Наталия зинченко: Зинченко, Наталья Николаевна — это… Что такое Зинченко, Наталья Николаевна?

Содержание

Наталья Зинченко

Бывший главный тренер ЖФК Звезда-2005, главный тренер женской футбольной сборной Украины

Родилась 3 октября 1979 года.

Воспитанница ФК «Элегия». Первый тренер Острянко Иван Николаевич.

Спортивная карьера.

1990 — 1991 год — ФК «Элегия», г. Бобровица.

1992 — 1994 год — ФК «Легенда», г. Чернигов.

1995 год — ФК «Алина», г. Киев.

1996 год — ФК «Дончанка», г. Донецк.

1997 — 2002 год — ФК «Рязань-ВДВ», г. Рязань.

2002 — 2004 год — ФК «Энергия», г. Воронеж.

2005 — 2006 год — ФК «Рязань-ВДВ», г. Рязань.

2007 год — ФК «Звезда 2005», г. Пермь, чемпион России, обладатель Кубка России.

2008 год — ФК «Звезда-2005», г. Пермь, чемпион России.

2009 год — ФК «Звезда-2005», г. Пермь, чемпион России, финалист Кубка УЕФА.

Чемпион России 1999, 2000, 2002, 2003, 2007, 2008, 2009, чемпион Украины 1996.

Обладатель Кубка России 1998, 2007, Кубка Украины 1995, 1996.

Тренерская карьера.

В июле 2010 года назначена исполняющей обязанности главного тренера ЖФК «Звезда-2005» вместо Шека Борковски. С сентября 2010 года по май 2011 года — главный тренер ЖФК «Звезда-2005», с ноября 2011 года до конца сезона 2011/12 снова работала главным тренером клуба.

В конце 2012 года Наталья Зинченко была назначена на пост главного тренера молодежной женской сборной Украины WU19. Свой первый матч, в качестве наставника сборной, провела на международном товарищеском турнире «Кубанская весна» — 2013. Сборная Украины под руководством нового главного тренера со счетом 2:0 обыграла сборную Эстонии. На этом турнире сборная Украины WU19 впервые занимает второе место, проиграв в финале сборной США в серии послематчевых пенальти.

В 2014 году Наталья Зинченко повторяет прошлогоднее достижение и вновь сборная под ее руководством занимает 2 место на международном турнире «Кубанская весна» — 2014. В этот раз украинки уступили сборной России. Матч закончился со счетом 3:2.

В 2016 году приводит команду «Жилстрой-2» к первому в истории харьковчанок чемпионству Украины.

16 октября 2018 года Наталью Зинченко утвердили на пост главного тренера женской национальной сборной Украины.

Зинченко, Наталья Николаевна — Wikiwand

Клубная карьера

Первый тренер Иван Острянко.

Карьера тренера

В июле 2010 года стала исполняющим обязанности главного тренера в ЖФК «Звезда-2005»

[2]. С сентября 2010 года по май 2011 года — главный тренер ЖФК «Звезда-2005»[3][4], с ноября 2011 года до конца сезона 2011/12 снова работала главным тренером клуба[5].

В конце 2012 года Наталья Зинченко была назначена на пост главного тренера молодежной женской сборной Украины WU19. Свой первый матч, в качестве наставника сборной, провела на международном товарищеском турнире «Кубанская весна» — 2013. Сборная Украины под руководством нового главного тренера со счетом 2:0 обыграла сборную Эстонии. На этом турнире сборная Украины WU19 впервые занимает второе место, проиграв в финале сборной США в серии послематчевых пенальти

[6].

В 2014 году Наталья Зинченко повторяет прошлогоднее достижение и вновь сборная под её руководством занимает 2 место на международном турнире «Кубанская весна» — 2014. В этот раз украинки уступили сборной России. Матч закончился со счетом 3:2[7].

В 2016 году приводит команду «Жилстрой-2» к первому в истории харьковчанок чемпионству Украины[8].

16 октября 2018 года Наталью Зинченко утвердили на пост главного тренера женской национальной сборной Украины[9][10]. Стала первой женщиной, которая возглавила женскую национаньную сборную Украины. 14 ноября 2021 года завершила работу на должности главного тренера женской сборной Украины

[11]. Начиная с ноября 2018 года по ноябрь 2021 под руководством Зинченко национальная женская сборная провела 28 матчей: 14 побед, 3 ничьих, 11 поражений с разницей забитых и пропущенных мячей — 50-55[11]. За этот период в сборной дебютировали 16 футболисток[11].

Статистика

В разделе не хватает ссылок на источники (см. также рекомендации по поиску).Информация должна быть проверяема, иначе она может быть удалена. Вы можете отредактировать статью, добавив ссылки на авторитетные источники в виде сносок. Эта отметка установлена 10 марта 2018 года.

Клуб Сезон Чемпионат Кубок Еврокубки Прочие Всего
Матчи Голы Матчи Голы Матчи Голы Матчи Голы Матчи Голы
Рязань-ВДВ
1997 ? 1 ? 1 ? 2
1998 ? 5 ? ? 5
1999 ? ?
2000 ?
?
2001 ? 4 5 3 ? 7
2002 ? ?
Всего ? 10 ? 1 5 3 ? 14
Энергия (Воронеж) 2003 ? 6 ? 8 ? 14
2004 ? 11
?
2 ? 5 ? 18
Всего ? 17 ? 2 ? 13 ? 32
Рязань-ВДВ 2005 ? 8 ? 8
2006 ? 2 ? 2
Всего ? 10 ? 10
Звезда-2005 2007 14 9 ? 2 ? 11
2008 ? 10 ? 3 ? 13
2009 ? 5 ? 1 ? 1 ? 7
Всего ? 24 ? 3 ? 4 ? 31
Всего за карьеру ? 61 ? 6 ? 20 ? 87

Профайл пользователя НАТАЛИЯ (ЗИНЧЕНКО) nataliya_zinchenko. Знакомства портала DISLIFE

Калининград (Кенигсберг), Россия

  • Цель знакомства: Любовь, отношения
  • Образование: Высшее
  • Сфера деятельности: Другое
  • Семейное положение: Не замужем
  • Интересы, увлечения: НЕТИНТЕРЕСОВ ОЧЕНЬ МНОГО ИНТЕРЕСОВ -КОМПЬЮТОР,ВЯЗАНИЕ,КУЛИНАРИЯ,ВЕДУ СТРАНИЦУ В ОК .ПЕШИЕ ПРОГУЛКИТЕЛЕК НЕ СМОТРЮ НЕТ НА ЭТО ВРЕМЕНИ.
  • Вредные привычки: НЕТ
  • О себе: инв2гр,хожу на протезе справляюсь сама,очень одиноко, хочу познакомиться с мужчиной55-65лет все делаю готовлю щи, борщи и блинчики,а с мужчиной вообще что и не умею буду делать.

Адвокат Наталия Зинченко, Сергиев Посад, Россия, отзывы, контакты: телефон, адрес

Подробная информация об адвокате/юристе Наталия Зинченко — сфера деятельности, опыт работы, контактные данные, страницы в соцсетях.

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Родом из города: Воронеж
Высшее образование:
Вуз: СПФ МПУ (бывш. МАМИ СПФ, МГИУ СПФ) , 2009
Факультет: Юридический
Кафедра: Гражданско-правовых дисциплин и правоохранительных органов
Телефон:
Текущая деятельность: СПФ МПУ (бывш. МАМИ СПФ, МГИУ СПФ)

Адрес страницы: https://vk.com/id68678594

Другие адвокаты города Сергиев Посад

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: Сергиев Посад
Адвокат
Родом из города: Сергиев Посад
Дата рождения: 13 ноября
Высшее образование:
Вуз: СПФ МПУ (бывш. МАМИ СПФ, МГИУ СПФ) , 2011 , Заочное отделение , Выпускник (специалист)
Факультет: Экономический
Кафедра: Экономики и менеджмента
Среднее образование:
Школа: Школа №3 , 2004
1994 — 2004 (а)
Текущая деятельность: Адвокатская палата Московской области

Адрес страницы: https://vk.com/id3082137

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: школа-сад №1
Сергиев Посад 2005 — 2005
воспитатель группы продленного дня
Место работы: ОАО «ОК-Лоза»
Сергиев Посад 2005 — 2007
юрист
Место работы: Софрино
Сергиев Посад 2007 — 2007
художник-иконописец
Родом из города: Сергиев Посад
Дата рождения: 18 июня
Высшее образование:
Вуз: РГАУ — МСХА им. Тимирязева , Очное отделение , Студентка (специалист)
Факультет: Факультет зоотехнии и биологии
Кафедра: Зоологии
Вуз: МЭСИ (представительство) , Очное отделение
Факультет: Юридический
Среднее образование:
Школа: № 18 , 1999
1988 — 1999 (а)
Текущая деятельность: РГАУ — МСХА им. Тимирязева

Адрес страницы: https://vk.com/id10207858

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: Юрист
Москва 2005
Родом из города:
Дата рождения: 24 марта 1978
Высшее образование:
Вуз: МГЮА (Университет им. О. Е. Кутафина) , 2003 , Выпускник (специалист)
Среднее образование:
Школа: Школа №26 , 1995 Реммаш
1990 — 1995
Школа: Средняя школа , 1995
1985 — 1990
Текущая деятельность: Юрист

Адрес страницы: https://vk.com/id32651414

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: Сергиев Посад 2011
Адвокат
Родом из города:
Дата рождения: 1 апреля
Телефон:
Текущая деятельность: Юристы|Адвокаты

Адрес страницы: https://vk.com/id236597872

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Родом из города: Сергиев Посад
Дата рождения: 23 июля
Высшее образование:
Вуз: СПФ МПУ (бывш. МАМИ СПФ, МГИУ СПФ) , 2003 , Очное отделение , Выпускница (специалист)
Факультет: Юридический
Кафедра: Гражданско-правовых дисциплин и правоохранительных органов
Среднее образование:
Школа: Сергиево-Посадская (№1) , 1997 Сергиев Посад
1994 — 1997 (а)
Текущая деятельность: СПФ МПУ (бывш. МАМИ СПФ, МГИУ СПФ)

Адрес страницы: https://vk.com/id1763985

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: Сергиев Посад 2015
Стюардесса
Родом из города: Сергиев посад
Дата рождения: 30 декабря 1991
Телефон: 03
Текущая деятельность: Юристы|Адвокаты

Адрес страницы: https://vk.com/id460084859

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
Адвокат
Родом из города:
Высшее образование:
Вуз: МГЮА (Университет им. О. Е. Кутафина) , 2001
Среднее образование:
Школа: Гимназия № 5 , 1996 Сергиев Посад (а)
Текущая деятельность: Московская областная коллегия адвокатов

Адрес страницы: https://vk.com/id351127612

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: юрист

Дата рождения: 14 марта 1991
Телефон: 8777788989
Skype: works1403
Текущая деятельность: ФССП по г. Москва

Адрес страницы: https://vk.com/id104725235

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: адвокат

Дата рождения: 4 сентября 1991
Skype: jele4ka
Текущая деятельность: МГУПИ (СПФ)

Адрес страницы: https://vk.com/id40170257

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Дата рождения: 24 июня 1974
Телефон:
Текущая деятельность: ПВИ РВСН

Адрес страницы: https://vk.com/id108082891

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Дата рождения: 26 сентября 1983
Текущая деятельность: МЭСИ (представительство)

Адрес страницы: https://vk.com/id23007610

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: юрист

Дата рождения: 12 июля 1990
Текущая деятельность: Юрист

Адрес страницы: https://vk.com/id503712210

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Дата рождения: 26 апреля 1972
Телефон: Sony

Адрес страницы: https://vk.com/id170740062

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Дата рождения: 29 мая 1982
Текущая деятельность: ООО «МЕТТОЙЛ»

Адрес страницы: https://vk.com/id36916389

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: юрист

Дата рождения: 9 апреля 1984
Текущая деятельность: Фотостудия | THE LOFT CREATIVE STUDIO VAVA

Адрес страницы: https://vk.com/id10093111

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Дата рождения: 10 июня 1982
Текущая деятельность: Стройпроект

Адрес страницы: https://vk.com/id40594993

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Дата рождения: 23 февраля 1977
Текущая деятельность: юридическая фирма

Адрес страницы: https://vk.com/id74043247

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
адвокат
Дата рождения: 5 мая
Текущая деятельность: Страховой дом ВСК

Адрес страницы: https://vk.com/id18056726

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы: адвокат

Дата рождения: 15 ноября
Текущая деятельность: Администрация Сергиево-Посадского Муниципального Района

Адрес страницы: https://vk.com/id10047117

Страна проживания: Россия
Город: Сергиев Посад
Место работы:
юрист
Дата рождения: 30 июня
Телефон:

Адрес страницы: https://vk.com/id59851571

AMK — Наталья Николаевна Зинченко

 Без любви все — ничто


Обязанность без любви делает человека раздражительным.
Ответственность без любви делает человека бесцеремонным.
Справедливость без любви делает человека жестоким.
Правда без любви делает человека критиком.
Воспитанность без любви делает человека двуликим.
Ум без любви делает человека хитрым.
Приветливость без любви делает человека лицемерным.
Компетентность без любви делает человека неуступчивым.
Власть без любви делает человека насильником.
Честь без любви делает человека высокомерным.
Богатство без любви делает человека жадным.
Вера без любви делает человека фанатиком. 

«Любовь долготерпит, милосердствует, любовь не завидует, любовь не превозносится, не гордится, не бесчинствует, не ищет своего, не раздражается, не мыслит зла, не радуется неправде, а сорадуется истине: все покрывает, всему верит, всего надеется, все переносит.

      Любовь никогда не перестает…»

                                                                    1-е послание к Коринфянам. 13 гл.

   Дорогие коллеги!

Не секрет, что успешная модернизация системы здравоохранения, ее инновационное развитие, невозможно без современного высококвалифицированного специалиста, сформировать которого можно лишь через непрерывное профессиональное развитие.

Считаю необходимым в этом процессе ориентироваться на удовлетворение запросов заказчиков и потребителей образовательных услуг в лице студентов, руководителей и работников практического здравоохранения, общества и государства в целом.

Придаю особую значимость развитию общедоступных образовательных ресурсов, применению объективной и эффективной оценки качества, как основного, так и дополнительного среднего медицинского и фармацевтического образования.
На мой взгляд, основные пути реализации парадигмы «Образование через всю жизнь» связаны:
1. с развитием сети методических кабинетов в ЛПУ, обеспечение их современными источниками информации;
2. с обновлением стандартов, изданием учебно–методических пособий, созданием банка контрольно – измерительных материалов;
3. с открытием симуляционных тренинг-центров на практических базах;
4. с реализацией программ по разработке и внедрению стандартов простых сестринских услуг;
5. с созданием условий для освоения новых методик через мастер классы по специальностям, стажировки на рабочих местах в ведущих лечебно – профилактических учреждениях, которые могли бы стать экспериментальными площадками;
6. с оборудованием эталонных рабочих мест в ЛПУ;
7. с проведением научно – практических конференций, организацией постоянной действующих семинаров по актуальным темам;
8. с применением кредитно – модульной (накопительной) системы организации учебного процесса;
9. с развитием дистанционных форм обучения в системе непрерывного профессионального образования.

                   С пожеланиями Любви

        Директор ГАПОУ АО «Архангельский медицинский колледж», заслуженный работник здравоохранения РФ, главный внештатный специалист по управлению сестринской деятельностью министерства здравоохранения Архангельской области Н.Н. Зинченко

    Адрес:  163002, г. Архангельск , пр. Новгородский д. 21
    Электронная почта:   [email protected]

Телефон/факс: (88182)68-30-52

Уважаемые коллеги, у вас есть возможность обратиться с предложениями, поделиться информацией и задать вопрос по интересующей Вас  проблеме, воспользовавшись предложенной формой.


Усть-Илимск славится талантами своих жителей

Недавно педагоги и учащиеся школы искусств №2 имени Т.Г. Сафиулиной демонстрировали свои навыки и творческие работы на областной выставке-конкурсе народных ремесел «Сибирь мастеровая». Многие стали призерами в своих номинациях.

Неизменным участником подобных мероприятий на протяжении нескольких лет является преподаватель росписи по дереву Наталья Зинченко. Наталья Гарольдовна рассказывает, что в детстве у нее не проявлялось каких-то особых наклонностей к рисунку и живописи. Как все девочки, любила раскраски, плела фенечки.

Фото из архива Натальи Зинченко

Начало

После окончания школы №9 Наталья поступила заочно в Московский социальный открытый университет на психолога. Однажды ее однокурсница рассказала, что с удовольствием посещает занятия в школе ремесел. Наталью удивило, что там учатся достаточно взрослые люди. Рассказ однокурсницы настолько заинтересовал, что она тоже решила прийти на необычные занятия.

Это был 2000 год. Наталья Зинченко с теплом вспоминает своего первого учителя – Татьяну Бузину, которая потом передала своих учениц молодому педагогу Елене Михеенковой. В группе «Роспись по дереву» собрались девчонки как на подбор: стройные и симпатичные. Елена Михеенкова даже поначалу растерялась: «Что я буду с ними делать? Зачем этим девушкам с модельной внешностью все это нужно? Ох, и намучаюсь я с ними!» Но вскоре педагог увидела в своих ученицах настоящих тружениц.

– Когда я сюда пришла, конечно, не понимала, чем отличается городецкая роспись от хохломы, урало-сибирской росписи. Я была очень далека от всего этого, – вспоминает Наталья Зинченко. – Смотрю, девчонки так быстро рисуют, казалось, все им легко удается, а попробовала сама – тяжело! Долго сидела, упорно тренировалась. Мы делали флористические композиции из соломки, выполняли зарисовки сибирской растительности в хохломе, в «городце», в урало-сибирской росписи. Елена Николаевна с Татьяной Валерьевной старались всегда придумать что-то новое, не было такого, чтобы у всех была одна и та же композиция, к каждой ученице они находили индивидуальный подход, выискивали, у кого какие есть предпочтения. Они старались заинтересовать человека. Я до сих пор советуюсь с Еленой Николаевной, прислушиваюсь к ее мнению. Без преувеличения могу сказать, что благодаря народному мастеру Иркутской области Елене Михеенковой считается, что усть-илимская школа росписи по дереву – самая лучшая во всем Приангарье.

«Ученики – мои сподвижники!»

Елена Михеенкова с первых дней заметила потенциал у своей ученицы и после трех лет ее обучения предложила Наталье Зинченко прийти в школу искусств уже в качестве педагога отделения народного декоративно-прикладного искусства. Наталья, не раздумывая, согласилась.

– Не жалеешь, что пришлось отказаться от профессии психолога? – спрашиваю у Натальи.

– Абсолютно не жалею! – сходу отвечает она. – Я никогда не думала, что роспись по дереву станет не только моей основной, но еще и любимой профессией. Ежедневно работаю с кисточкой, оставляю ее на время, когда мы семьей уезжаем куда-нибудь в отпуск. У нас, как у спортсменов: месяц-два не потренировался – рука начинает забывать, и тяжело входить потом в рабочий ритм.

Мастер призналась, что сама еще до сих пор учится, проходит дополнительные курсы. К примеру, самостоятельно изучила мезенскую роспись, которую сейчас ввели в учебную программу. Сначала осваивала эту технику по книгам, потом нашла мастеров из Новосибирска, которые ездили в этнографические экспедиции и многое рассказали.

– Большим двигателем для меня является группа взрослых учеников, которые приходят на занятия уже со своими идеями, – говорит Наталья. – Ребенка не так интересует, какие сейчас веяния есть в росписи, а взрослые все отслеживают и хотят новые замыслы применять в интерьере, для подарков. Ведь ко мне приходят одни и те же ученики на протяжении 6-7 лет, и каждый раз надо их чем-то удивлять, людям хочется совершенствоваться. И мне приходится создавать новые мастер-классы, изучать новые техники. Так и живу в этом непрерывном процессе, и это очень интересно! Среди моих учеников не было ни одного человека, кто бы хотел научиться, но не смог.

Талантливый педагог дает своим ученикам не только основы традиционных росписей, но и формирует индивидуальный стиль. Так, недавно Наталья Зинченко вместе со своей ученицей Екатериной Ситниковой разработали сувенирную линейку в виде матрешек «Илим и Илимка». Фигурки символизируют молодых людей – строителей города. За эту коллективную работу авторы были удостоены диплома второй степени в конкурсе «Туристические сувениры», который проходил в городе Улан-Удэ. Кстати, Екатерина Ситникова пришла заниматься к Наталье Зинченко после того, как у нее отучились ее две дочери.

Также занимают призовые места в различных выставках другие ученики нашей героини: Алла Шаповалова, Марина Бабивская, Валентина Бутенко, семья Дахиных, Наталья Кислицына. А 16-летняя Виктория Уварова стала участницей Дельфийских игр и прошла недавно отборочный тур в Иркутской области. Усть-Илимск был единственный, кто представлял роспись по дереву на этом значимом конкурсе.

Многие ученики Натальи Зинченко продолжают заниматься дома. Некоторые пошли учиться в училища и вузы изобразительного искусства.

Выставки пока никто не отменял

Наталья Гарольдовна может говорить о любимой работе и своем дружном творческом коллективе бесконечно. Она считает, что в жизни человеку должны пригодиться любые навыки, ничто не проходит бесследно.

– У меня обучались дети с проблемами здоровья, – рассказывает педагог. – Из-за гиперактивности их тяжело было усадить, но роспись не терпит суеты, с ней нужно работать медленно и аккуратно. Через полгода я увидела, что дети изменились. Они стали более спокойными, уже резко не подскакивали с места, плавно выводили рисунок. Роспись формирует в человеке усидчивость. Ее можно сравнить с уроком чистописания, который когда-то преподавали в школе.

На вопрос о ближайших перспективах Наталья Зинченко ответила:

– Как ни странно, но карантинные меры явились для нас стимулом к дальнейшему движению. И сейчас, когда дети иногда уходят на дистанционное обучение или болеют, я начинаю разрабатывать серию уроков именно для дистанционного обучения. Этот запрос был уже давно. Мои подписчики постоянно спрашивают об онлайн-курсах. И вот, это время, видимо, наступило. Буду записывать уроки и мастер-классы дистанционно для детей и взрослых. Кроме этого, пора уже готовиться к очередной областной выставке-конкурсу «Золотое дерево», ведь подобные мероприятия пока никто не отменял!


Елена Михеенкова, руководитель народного творческого объединения «Мастера Илима» школы искусств номер 2 имени Т.Г. Сафиулиной:

– В Наталье Гарольдовне Зинченко с первых дней почувствовался будущий мастер. У нее еще во время учебы в школе ремесел появился собственный стиль. Она очень большой труженик, а в ремесле это самое важное. У Натальи безукоризненная виртуозная техника. Кажется, что роспись ей настолько легко дается, что она может это делать с закрытыми глазами. Будто руки и душа рисуют сами по себе. Наталья никогда не останавливается на достигнутом, всегда ищет новое, пробует, экспериментирует. Сегодня моя вчерашняя ученица стала для меня учителем! Наталья Зинченко щедро делится с коллегами всем новым, что сама узнает, а это говорит о богатой душе настоящего мастера.

Отклики учеников

Екатерина Ситникова, 54 года:

– Любой человек, который встречается на пути, для чего-то нужен в вашей жизни. У Натальи Гарольдовны есть чему поучиться. Это очень дисциплинированный и организованный человек, и не только на работе, но и в обыденной жизни, умеющий прорабатывать любой вопрос тщательно и до последних мелочей. Порой удивляюсь, как и когда успела сформироваться такая мощная система качеств в молодой женщине! И радуюсь, что этот человек был и есть в моей жизни и в жизни моих детей.

Марина Бабивская, 39 лет:

– Я хожу на уроки «Роспись по дереву» для взрослых с января 2018 года. Наталья Гарольдовна отзывчивая, доброжелательная, жизнерадостная, творческая личность. Ее отличают высокая работоспособность, требовательное отношение к результатам своей работы, высокий уровень профессиональных знаний. На ее уроках благоприятный психологический климат. Она умеет преподнести материал доступно, эмоционально, увлечь учащихся глубоким изучением материала. Творческий оптимизм и неподдельная любовь к своему делу плодотворно влияют на всех учеников, побуждают стремиться к новым знаниям.

Достижения Натальи Зинченко

  • Лауреат областного конкурса «Молодость. Творчество. Современность».
  • Лауреат 2-й степени Байкальского международного фестиваля «Хоровод ремесел на земле Иркутской», Иркутск, 2020 г.
  • Лауреат первой степени в номинации «Художественная роспись» в категории «Мастер-профи», областная выставка-конкурс народных ремесел, Иркутск, 2020 г. (Конкурсная работа отдана в дар в Иркутский областной краеведческий музей).
  • Специальный диплом областной выставки-конкурса «Золотое дерево», номинация «Мастер-профи», Усть-Илимск, 2019 г.
  • Серебряный призер в номинации «Линейка туристических сувениров города «Сувенирные куклы Илим и Илимка». Окружной этап Всероссийского конкурса «Туристический сувенир» 2019 г., в соавторстве с Е.И.Ситниковой.
  • Гран-при областной выставки-конкурса «Золотое дерево», г. УстьИлимск.
  • Диплом первой степени — национальная молодежная общественная награда «Будущее России» в номинации «Молодой творческий деятель», Красноярск, 2016 г.
  • Благодарственные письма мэра города Усть-Илимска, 2012 г.
  • Почетная грамота мэра города Усть-Илимска, 2020 г.

Наталья Иванишина, «Вестник УИ ЛПК»

Наталия Зинченко о новых победах студентов и выпускников ИКИ — VERBUM

Уже более 15 лет ИКиИ обеспечивает страну и республику профессионалами в сфере культуры и искусства. Студенты института регулярно участвуют во всевозможных выставках и конкурсах, создают дизайн-проекты как для дипломных работ, так и на заказ. Выпускники работают в крупных городах России и за границей.

Не так давно выпускники института вновь проявили себя. Дипломные работы студентов ИКиИ заняли призовые места на региональном конкурсе «Зодчество». О «Зодчестве» и конкурсных проектах выпускников рассказала заведующий кафедрой дизайна Наталия Зинченко.

— Как давно проходит «Зодчество» и кто в нем участвует?
— Это ежегодный региональный конкурс архитектурно-дизайнерских проектов. Он проводится уже больше 10 лет. В нем принимают участие статусные фирмы и организации, которые занимаются проектированием. Свои работы представляют и студенты вузов Республики Коми. Также участвуют ученики гимназии искусств, но там совсем маленькие детки, в возрасте от 7 до 12 лет. И мы каждый год представляем на этом конкурсе лучшие дипломные работы наших выпускников. 
— Что дает студентам участие в этом конкурсе? Какие перспективы он открывает? 
— Выпускники охотно участвуют в таких мероприятиях, чтобы заявить о себе, посмотреть, какой необходим уровень для работы, узнать тенденции в дизайн-проектировании. Ведь в этом конкурсе участвуют и профессионалы, на которых можно равняться. Ну, и это все-таки творческие люди, им важно показать, что они умеют. Кроме того, все проекты и конкурсы идут в портфолио студентов, что важно при трудоустройстве. 
— Какие проекты представляли наши студенты? 
— Аркадий Габов представил «Дизайн хостела «Куратов»». В новом деловом центре Сыктывкара планируется создать хостел. Аркадий взял это за идею и представил свой проект. Он использовал спокойные тона и геометрические фигуры в интерьере.

Арсений Гусев создал «Дизайн-проект терренкура санаторного комплекса «Серегово»». Ему эта тема особенно близка, так как его родители имеют отношение к этому санаторию. Поэтому Арсений знает территорию и ее проблемы. Он разработал тропу для оздоровительных прогулок – терренкур. Он выстроил дизайн на основе истории села Серегово, ведь там традиционно добывали соль. Фрагменты этой истории и отражены в его проекте. У Арсения там продуманы оригинальные фонари и скамейки, которые он сам разработал. Он даже нашел фирму в Кирове, которая готова выполнить такой заказ. Сохранена эстетика лесной зоны за счет имитации грубых необработанных материалов. Он занял первое место в номинации «Дизайн среды» среди студентов. 

Валентина Бурименко разработала «Дизайн-проект групповой ячейки типового детского сада в стиле натургарден». В ее дизайне использованы лесные мотивы, у детей должно сформироваться ощущение, что они в сказочном лесу. В качестве материала преимущественно используется древесина. Здесь и фигуры животных, деревьев, даже спинки кроватей выполнены в форме елочек. Она заняла второе место в номинации «Дизайн интерьера». 

Елена Вокуева представила «Дизайн-проект зоны свадебных церемоний на территории финно-угорского этнокультурного парка Ыб». На нас вышли руководители этого парка и высказали необходимость проектирования этой территории. Ее проект занял второе место в номинации «Дизайн-проекты». 

Анастасия Грумандь и ее «Дизайн-проект интерьеров гостевого дома по мотивам иллюстраций В.Г. Игнатова к мифам и легендам Коми» заняла первое место в номинации «Дизайн интерьера». Сейчас многие любят на выходные выезжать поближе к природе и погружаться в привычную для определенного народа среду. Анастасии удалось передать всю эстетику иллюстраций Игнатова через цветовую гамму интерьера и мебель. 

Эльвира Бобылева представила очень необычный проект «Разработка дизайна на основе морских контейнеров». В западной Европе не так давно предложили использовать такие контейнеры для строительства домов. Это относительно дешевый проект. Но если строить в условиях севера, необходимо также учитывать стоимость утеплителя. Эльвира сделала интерьер в красном, сером, белом и черном цветах. Получилось очень молодежно. Для гостевого дома будет идеально, порадует посетителей. 

Карина Миргаязова и Даша Косинцева вместе работали над серьезным проектом «Оформление интерьеров и фасада железнодорожного вокзала». Вокзал сейчас выглядит не совсем хорошо. Взять решили три помещения и создать эффект цветовой гаммы нашей республики: два зала ожидания (один в синем цвете, другой в выбеленном сером) и между ними центральная проходная зона (в зеленом цвете). Фасад предполагается выполнять в светло-оливковом оттенке, а также использовать оформление барельефом гербов крупных городов республики. Участницы предусмотрели и вечерний дизайн, продумав подсветку здания в темное время суток. Также залы ожидания оформлены выставками фотографий разных периодов истории города. Кроме того, разработан «компас» на полу проходной зоны. Там по кругу располагаются города с указанием, сколько от Сыктывкара километров до каждого из них. Это особенно удачно, так как этот «компас» располагается ровно под куполом потолка. 

Даниил Ватаманов предложил «Дизайн охотничьего клуба «Медведь»». Предполагалось, что это клуб для любителей охоты и рыбалки, поэтому внутри все выполнено в достаточно брутальном стиле. Это достигается за счет имитации необработанного дерева, светильников в стиле средневековья, псевдо шкур медведей. 

— Где обычно проходит этот конкурс? 
— «Зодчество» организуется на разных площадках города. Что раньше для нас было не совсем удобно. Студенты не могли в полной мере участвовать в конкурсе из-за своей загруженности. Но в этом году впервые конкурс прошел на базе ИКиИ, что расширило наши возможности. При благоприятных условиях, планируется, что и в следующем году «Зодчество» пройдет в выставочном зале нашего института. 
— Все эти проекты реализуемы или воплотить их в жизнь нет возможности? 
— Проекты студентов не что-то из области фантастики, они вполне реализуемы. К сожалению, сейчас в условиях финансового кризиса дизайн не особо популярен, потому что не является чем-то необходимым. Даже в мастерских дизайна на данный момент не так много заказов. Хотя иногда мы разрабатываем проекты по просьбе каких-либо учреждений. В прошлом году, например, мы работали над фирменным стилем экопарка Марьямоль. В настоящий момент мы разрабатываем проект интерьеров детского дома №20. Здесь мы не могли остаться в стороне, поэтому помогаем создать проект, под который в дальнейшем они смогут получить деньги. 

Санкционная политика — наши внутренние правила

Эта политика является частью наших Условий использования. Используя любой из наших Сервисов, вы соглашаетесь с этой политикой и нашими Условиями использования.

Как глобальная компания, базирующаяся в США и осуществляющая деятельность в других странах, Etsy должна соблюдать экономические санкции и торговые ограничения, включая, помимо прочего, те, которые введены Управлением по контролю за иностранными активами («OFAC») Департамента США. казначейства. Это означает, что Etsy или любое другое лицо, использующее наши Сервисы, не может принимать участие в транзакциях, в которых участвуют определенные люди, места или предметы, происходящие из определенных мест, как это определено такими агентствами, как OFAC, в дополнение к торговым ограничениям, налагаемым соответствующими законами и правилами.

Эта политика распространяется на всех, кто пользуется нашими Услугами, независимо от их местонахождения. Ознакомление с этими ограничениями зависит от вас.

Например, эти ограничения обычно запрещают, но не ограничиваются транзакциями, включающими:

  1. Определенные географические области, такие как Крым, Куба, Иран, Северная Корея, Сирия, Россия, Беларусь, Донецкая Народная Республика («ДНР») и Луганская Народная Республика («ЛНР») области Украины, или любое физическое или юридическое лицо, работающее или проживающее в этих местах;
  2. Физические или юридические лица, указанные в санкционных списках, таких как Список особо обозначенных граждан (SDN) OFAC или Список иностранных лиц, уклоняющихся от санкций (FSE);
  3. Граждане Кубы, независимо от местонахождения, если не установлено гражданство или постоянное место жительства за пределами Кубы; и
  4. Предметы, происходящие из регионов, включая Кубу, Северную Корею, Иран или Крым, за исключением информационных материалов, таких как публикации, фильмы, плакаты, грампластинки, фотографии, кассеты, компакт-диски и некоторые произведения искусства.
  5. Любые товары, услуги или технологии из ДНР и ЛНР, за исключением подходящих информационных материалов и сельскохозяйственных товаров, таких как продукты питания для людей, семена продовольственных культур или удобрения.
  6. Ввоз в США следующих товаров российского происхождения: рыбы, морепродуктов, непромышленных алмазов и любых других товаров, время от времени определяемых министром торговли США.
  7. Вывоз из США или лицом США предметов роскоши и других предметов, которые могут быть определены США.S. Министр торговли, любому лицу, находящемуся в России или Беларуси. Список и описание «предметов роскоши» можно найти в Приложении № 5 к Части 746 Федерального реестра.
  8. Товары, происходящие из-за пределов США, на которые распространяется действие Закона США о тарифах или связанных с ним законов, запрещающих использование принудительного труда.

Чтобы защитить наше сообщество и рынок, Etsy принимает меры для обеспечения соблюдения программ санкций. Например, Etsy запрещает участникам использовать свои учетные записи в определенных географических точках.Если у нас есть основания полагать, что вы используете свою учетную запись из санкционированного места, такого как любое из мест, перечисленных выше, или иным образом нарушаете какие-либо экономические санкции или торговые ограничения, мы можем приостановить или прекратить использование вами наших Услуг. Участникам, как правило, не разрешается размещать, покупать или продавать товары, происходящие из санкционированных районов. Сюда входят предметы, которые были выпущены до введения санкций, поскольку у нас нет возможности проверить, когда они были действительно удалены из места с ограниченным доступом. Etsy оставляет за собой право запросить у продавцов дополнительную информацию, раскрыть страну происхождения товара в списке или предпринять другие шаги для выполнения обязательств по соблюдению.Мы можем отключить списки или отменить транзакции, которые представляют риск нарушения этой политики.

В дополнение к соблюдению OFAC и применимых местных законов, члены Etsy должны знать, что в других странах могут быть свои собственные торговые ограничения и что некоторые товары могут быть запрещены к экспорту или импорту в соответствии с международными законами. Вам следует ознакомиться с законами любой юрисдикции, когда в сделке участвуют международные стороны.

Наконец, члены Etsy должны знать, что сторонние платежные системы, такие как PayPal, могут независимо контролировать транзакции на предмет соблюдения санкций и могут блокировать транзакции в рамках своих собственных программ соответствия.Etsy не имеет полномочий или контроля над независимым принятием решений этими поставщиками.

Экономические санкции и торговые ограничения, применимые к использованию вами Услуг, могут быть изменены, поэтому участникам следует регулярно проверять ресурсы по санкциям. Для получения юридической консультации обратитесь к квалифицированному специалисту.

Ресурсы: Министерство финансов США; Бюро промышленности и безопасности Министерства торговли США; Государственный департамент США; Европейская комиссия

Последнее обновление: 18 марта 2022 г.

Наталья Зинченко

Наталья Зинченко
Личная информация
Полное имя Наталья Зинченко
Дата рождения 3 октября 1979 г. ( 1979-10-03 )(32 года)
Место рождения Украина
Высота 1.69 м (5 футов 6 1 2 дюймов)
Игровая позиция полузащитник
Информация о клубе
Текущий клуб пенсионер
Старший карьерный*
Годы Команда Приложения (Глс)
1995 Алина Киев
1996 Дончанка
1997-2002 Рязань
2002–2004 Энергия Воронеж
2005–2006 Рязань
2007–2010 Звезда Пермь
Сборная
1995–2010 Украина
Команды под управлением
2011– Звезда Пермь
* Матчи за взрослые клубы и голы засчитываются только для национальных лиг.
† Появления (голы).

Наталия Зинченко (укр. Наталья Зинченко; род. 3 октября 1979 г.) — бывшая украинская футболистка, в настоящее время является менеджером «Звезды Пермь».

Карьера

Зинченко присоединился к «Звезде Пермь» в 2007 году [1] и, кроме того, был капитаном команды. Ранее она выступала за рязанский ВДВ. [3] После выхода на пенсию из-за травмы в 2010 году она заменила Шека Борковски на посту менеджера «Звезды Пермь». [4]

За свою карьеру выиграла семь чемпионатов России, два кубка России, два чемпионата Украины и один кубок Украины.

Международная карьера

Она была членом сборной Украины [5] и дебютировала 22 октября 1995 года против Венгрии.

Ссылки

v · d · Сборная Украины – Чемпионат Европы-2009 среди женщин
1 Zvarych • 2 Mazurenko • 3 Chorna • 4 Kotyk • 4 Kotyk • 5 Yakovyshyn • 6 Pekur • 7 Ходырева • 8 Boychenko • 9 Dyatel • 9 Dyatel • 10 Фришко • 10 11 11 Zinchenko 12 Баранова • 13 Tytova • 14 Ващенко • 14 LEMESHKO • 16 LEMESHAFAY • 16 Апанащенко • 17 Sukhorukova • 19 Sukhoruka • 20 Василюк • 21 Романенко • 22 Самсон • Тренер: Куцев
Личные данные
Имя Зинченко Наталья
Альтернативные названия
Краткое описание Украинский футболист
Дата рождения 3 октября 1979 г.
Место рождения
Дата смерти
Место смерти

Наталья Зинченко — Состояние, Возраст, Рост, Биография, День рождения, Вики!

Наталья Зинченко состояние, день рождения, возраст, рост, вес, вики, факт 2020-21! В этой статье мы узнаем, сколько лет Наталье Зинченко? С кем сейчас встречается Наталья Зинченко и сколько у Натальи Зинченко денег?

    2 недоступен
    2 Мать
    2 Spouse
      2 не известен
короткий профиль
Sibdings
Дети (ы) Нет в наличии

Наталья Зинченко Биография

Наталья Зинченко известная Бывшая Футболистка , родившаяся 3 октября 1979 в Россия .По мнению Астрологов, знака зодиака Натальи Зинченко — это Весов .

Наталия Зинченко (укр. Наталія Зинченко; родилась 3 октября 1979 г.) — бывшая украинская футболистка, которая в настоящее время является менеджером «Звезды Пермь».

Входила в состав сборной Украины и дебютировала 22 октября 1995 года против сборной Венгрии.

[ИКС]

Этническая принадлежность, религия и политические взгляды

Многие люди хотят знать, что такое Наталья Зинченко этническая принадлежность, национальность, родословная и раса? Давайте проверим это! Согласно общедоступному ресурсу IMDb и Википедии, этническая принадлежность Натальи Зинченко неизвестна. В этой статье мы обновим религиозные и политические взгляды Натальи Зинченко. Пожалуйста, проверьте статью еще раз через несколько дней.

Зинченко присоединился к «Звезде Пермь» в 2007 году и, кроме того, был капитаном команды, под этой должностью команда дошла до финала женского Кубка УЕФА 2008-09. Ранее она выступала за рязанский ВДВ. Выйдя на пенсию из-за травмы в 2010 году, она заменила Шека Борковски на посту менеджера «Звезды Пермь».

Наталья Зинченко Чистая стоимость

Наталья Зинченко входит в список самых богатых бывших футболистов и входит в список самых популярных бывших футболистов.Согласно нашему анализу, Википедии, Forbes и Business Insider, Наталья Зинченко собственный капитал составляет примерно 1,5 миллиона долларов .

Чистая стоимость
    2 $ 1,5 млн.
    2 Бывший футболист
    2 автомобили
Natalya Zinchenko Чистая стоимость и заработная плата
    4
зарплата
Источник дохода
Нет в наличии
Дом Проживание в собственном доме.

Зинченко присоединился к «Звезде Пермь» в 2007 году и, кроме того, был капитаном команды, под этой должностью команда дошла до финала женского Кубка УЕФА 2008-09. Ранее она выступала за рязанский ВДВ. Выйдя на пенсию из-за травмы в 2010 году, она заменила Шека Борковски на посту менеджера «Звезды Пермь».

Зинченко Наталья Рост

Рост Натальи Зинченко 1,69 м вес Неизвестно и параметры тела скоро обновятся.

6 м 9009 м
    2 измерения тела
      2 под отзером
Наталья Зинченко высота и статистика тела
Цвет глаз не доступен
Цвет волос Нет в наличии
Размер ноги/обуви Нет в наличии

С кем встречается Наталья Зинченко?

По нашим данным, Наталья Зинченко возможно не замужем и ранее не была помолвлена.По состоянию на декабрь 2021 года Наталья Зинченко ни с кем не встречается.

Запись отношений : У нас нет записей о прошлых отношениях для Натальи Зинченко. Вы можете помочь нам установить рекорды знакомств для Натальи Зинченко!

Факты и мелочи

Входит в список самых популярных бывших футболистов . Также входит в элитный список известных знаменитостей рождения России . Наталья Зинченко празднует день рождения 3 октября каждого года.

Полную биографию Натальи Зинченко вы можете прочитать в Википедии.

Белок, родственный фукутину, необходим для развития мышц, мозга и глаз мышей, а мутация резюмирует широкий клинический спектр дисстрогликанопатий | Молекулярная генетика человека

Аннотация

Мутации в родственном фукутину белке (FKRP) вызывают распространенное подмножество мышечных дистрофий, характеризующееся аберрантным гликозилированием альфа-дистрогликана (α-DG), в совокупности известных как дисстрогликанопатии.Клинические вариации, связанные с мутациями FKRP, варьируются от легкой поясно-конечностной мышечной дистрофии типа 2I с преимущественно мышечными фенотипами до тяжелого синдрома Уокера-Варбурга и мышечно-глазно-мозгового заболевания с выраженными структурными дефектами головного мозга и глаз. В настоящем исследовании мы создали модели животных и продемонстрировали, что абляция функций FKRP приводит к летальному исходу эмбрионов и что гомозиготные нулевые эмбрионы умирают до достижения стадии E12.5. У гомозиготных нокаутированных мышей, несущих миссенс-мутацию P448L, почти полностью отсутствует функциональное гликозилирование α-DG в мышцах и головном мозге, что подтверждает существенную роль FKRP в функциональном гликозилировании α-DG.Однако нокаутированная мышь выживает, и у нее развивается широкий спектр структурных аномалий в центральной нервной системе, характерных для дефектов миграции нейронов. Дефекты головного мозга и глаз очень напоминают фенотипы, наблюдаемые у пациентов с тяжелой дистрогликанопатией. Кроме того, в скелетных мышцах развивается прогрессирующая мышечная дистрофия. Наши результаты подтверждают, что посттрансляционные модификации α-DG необходимы для нормального развития мозга и глаз. Кроме того, как сама мутация, так и уровни экспрессии FKRP одинаково важны для выживания животных.Исключительно широкий клинический спектр, повторенный у мышей P448L, также предполагает участие других факторов в прогрессировании заболевания. Мутантная мышь представляет собой ценную модель для дальнейшего выяснения функций FKRP и разработки методов лечения связанных с FKRP мышечных дистрофий.

ВВЕДЕНИЕ

Комплекс дистрофин-гликопротеин (DGC) в сарколемме обеспечивает физическую связь между актиновым цитоскелетом и внеклеточным матриксом (ECM), что имеет решающее значение для поддержания стабильности мышечной мембраны (1,2).Хорошо известно, что нарушение этой связи вызывает различные формы мышечных дистрофий (3). Дистрогликан (DG) является важным компонентом DGC (4,5). Полипептид посттрансляционно расщепляется на две тесно связанные субъединицы DG: α-DG и β-DG (6). α-DG в значительной степени гликозилирован как N-, так и O-связанными гликанами и действует как клеточный рецептор для ламинина и других белков ECM, включая агрин, перлекан, нейрексин и пикачурин (7–13). Функция α-DG и его взаимодействие с белками ECM в значительной степени зависят от O-связанного гликозилирования в муциноподобном домене (центральная область) полипептида (2,14,15).Хотя ДГ первоначально был характерен для скелетных и сердечных мышц, он также играет важную роль в развитии головного мозга, глаз и периферических нервов (16–20).

В последнее время подгруппа мышечных дистрофий, известная как дистрогликанопатии, характеризуется общим вторичным дефектом гликозилирования DG. Дефект является результатом аутосомно-рецессивных мутаций как минимум в шести различных генах (21). Их примеры включают родственный фукутину белок ( FKRP ), фукутин , LARGE , POMGnT1 , POMT1 и POMT2 .В ряде исследований предполагается, что эти гены участвуют в посттрансляционных модификациях α-DG (22–28). Было показано, что POMT1, POMT2 и POMGnT1 инициируют первые два этапа пути O-маннозилирования, уникального типа O-связанного гликозилирования в α-DG (25, 29). Имеются также данные, подтверждающие, что LARGE является гликозилтрансферазой (30–32). Напротив, функции FKRP в значительной степени неизвестны. Хотя мутации в гене связаны с гипогликозилированием α-DG, нет биохимических данных, подтверждающих его прямое участие в модификациях α-DG (33).

Клинические спектры дисстрогликанопатий могут значительно различаться. Тяжелый конец спектра включает синдром Уокера-Варбурга (СВВ), вызванный мутациями в генах POMT1 и POMT2 , мышечно-глазно-мозговое заболевание (MEB), вызванное мутациями в гене POMGnT1 , и врожденный синдром Фукуямы. мышечная дистрофия, вызванная мутациями в гене фукутина . Эти расстройства демонстрируют значительные дефекты, в том числе отчетливые структурные изменения в головном мозге (лиссэнцефалия типа булыжника II) и глазах (гипоплазия сетчатки), в центральной нервной системе (ЦНС) и часто приводят к ранней летальности.Мутации в некоторых генах дистрогликанопатии часто связаны с различной клинической тяжестью. В частности, сообщалось, что генетические дефекты в FKRP вызывают клинически различные заболевания от WWS и MEB до менее тяжелых врожденных мышечных дистрофий (MDC1C) с поражением ЦНС или без него и легкой поясно-конечностной мышечной дистрофии типа 2I (LGMD2I) с преимущественно миопатическими фенотипы (34–36). Кардиомиопатия также наблюдается у некоторых пациентов с LGMD2I (37,38). Недавние исследования мышечных дистрофий, связанных с FKRP, не смогли установить четкую корреляцию генотип-фенотип, объясняющую эти вариации (39).Кроме того, было показано, что уровни гликозилирования α-DG, определяемые иммуноокрашиванием биоптатов мышц, различаются у пациентов (39, 40). Кроме того, недавнее исследование показало, что нокаут-модель мыши с гомозиготной миссенс-мутацией Y307N [вместе с кассетой устойчивости к неомицину (Neo r )] в гене FKRP экспрессирует относительно обильную функциональную α-DG, но животные умирали при рождении или вскоре после него, что поднимает вопрос о том, необходим ли FKRP для функционального гликозилирования α-DG, и о возможности того, что другие факторы также могут влиять на тяжесть заболевания (41).

В этом исследовании мы создали две модели мышей, используя технологии нокаута и нокаута для изучения функциональной роли FKRP при мышечных дистрофиях. Во-первых, мы создали миссенс-мутацию P448L в мышином гене Fkrp . Эта мутация ранее была связана с MDC1C (28, 36) и, как было показано, влияет на локализацию белка FKRP (42, 43). Гомозиготные нокаутированные мыши жизнеспособны и повторяют вариабельные клинические фенотипы мышечных дистрофий, связанных с FKRP.Помимо дистрофической патологии в скелетных мышцах, у мутантных животных также развиваются выраженные аномалии в головном мозге и глазах, связанные с тяжелыми формами дисстрогликанопатий. Биохимический анализ показал, что α-DG функционально не гликозилирован, о чем свидетельствует потеря его гликоэпитопов и способность связывать ламинин. С др. стороны, делеция С-концевого консенсусного мотива DxD в FKRP приводит к ранней эмбриональной летальности. Вместе наши результаты ясно демонстрируют важную роль FKRP как во время эмбрионального, так и постэмбрионального развития мышц и ЦНС.Аномалии, наблюдаемые у мутантных мышей, подтверждают текущую гипотезу о том, что FKRP необходим для функциональных модификаций α-DG. Однако значительная активация β 1 -интегрина в мутантных мышцах указывает на то, что другие факторы также могут быть ответственны за широкое разнообразие тяжести заболевания. Гомозиготные мыши P448L очень ценны не только для выяснения механизма заболевания и прогрессирования в долгосрочных исследованиях, но и для разработки терапевтических стратегий для связанных с FKRP мышечных дистрофий в будущем.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение мышей с нокаутом и делецией FKRP

Для создания нокаутной животной модели мы разработали нацеливающий вектор, содержащий точечную мутацию C1343T в экзоне 3 мышиного гена Fkrp . Возникшая в результате миссенс-мутация изменила аминокислоту в положении 448 с пролина на лейцин (P448L). Neo r был вставлен в интрон 2 и фланкирован двумя сайтами узнавания loxP и FRT (фиг.1А–С). Клетки-мишени ES были идентифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и подтверждены Саузерн-блоттингом перед инъекцией в бластоциты (дополнительный материал, рис. S1A). Всю кодирующую область FKRP всех положительных клонов ES секвенировали для подтверждения мутации P448L. Получали гетерозиготных мышей, передающихся по зародышевой линии, и скрещивали для получения гомозиготных мышей с нокаутом FKRP (далее называемых мутантными мышами FKRP-neo-P448L/FKRP-neo-P448L или FKRP-neo-P448L). Генотип мышей был идентифицирован с помощью аллель-специфических праймеров для ПЦР, которые могут отличать аллели дикого типа от целевых аллелей FKRP (дополнительный материал, рис.С1Б). Интеграция целевого вектора в локус FKRP была повторно подтверждена с помощью ПЦР с использованием одного праймера, соответствующего геномной последовательности, не включенной в целевой вектор, и другого, соответствующего последовательности Neo r (дополнительный материал, рис. S1C). Сконструированная мутация P448L была дополнительно подтверждена секвенированием геномной ДНК. Поскольку в нескольких недавно проведенных исследованиях было показано, что модели мышей с нокаутом FKRP и саркогликанов не развивали фенотипы после удаления кассеты Neo r , мы решили сохранить кассету Neo r в целевых аллелях FKRP (41,44). ,45).

Рисунок 1.

Схематическая диаграмма стратегии таргетинга. ( A ) Аллели FKRP дикого типа. Некодирующий экзон 2 и кодирующий экзон 3 мышиного гена FKRP показаны незакрашенными прямоугольниками. Направление перевода обозначено стрелкой под прямым углом. Пунктирная линия представляет собой геномную последовательность, не включенную в нацеливающий вектор. Наборы аллель-специфических ПЦР-праймеров для генотипирования аллеля дикого типа обозначены противоположными стрелками (8010/PT5 и 4714/rN374).Зонд PB3/4 использовали для идентификации положительных клонов ES в Саузерн-блотах геномной ДНК, расщепленной с помощью Eco RV (E). ( B ) Нацеленный вектор P448L. Длинное плечо (LA) и короткое плечо (SA) представлены двойными стрелками. Кассета, устойчивая к неомицину (Neo r ), была встроена в 5′-конец кодирующей последовательности FKRP и фланкирована двумя сайтами узнавания loxP и FRT (открытые стрелки). Звездочка в экзоне 3 обозначает миссенс-мутацию P448L. ( C ) Целевой аллель P448L после гомологичной рекомбинации.Аллель-специфические наборы праймеров для ПЦР для генотипирования аллеля P448L обозначены противоположными стрелками (F3/PT5 и A1/UNI). Обратите внимание на наличие новой площадки Eco RV (E) в кассете Neo r . ( D ) Вектор наведения E310del. Звездочка в экзоне 3 обозначает укороченную делецию Е310, в которой была удалена кодирующая последовательность FKRP после аминокислоты Е310. Кассета Neo r с флоксом была вставлена ​​на 3′ оставшейся кодирующей последовательности FKRP. ( E ) Аллель-мишень E310del после гомологичной рекомбинации.Аллель-специфический набор праймеров для ПЦР для генотипирования аллеля E310del обозначен противоположными стрелками (4714/Neo1).

Рисунок 1.

Схематическая диаграмма стратегии таргетинга. ( A ) Аллели FKRP дикого типа. Некодирующий экзон 2 и кодирующий экзон 3 мышиного гена FKRP показаны незакрашенными прямоугольниками. Направление перевода обозначено стрелкой под прямым углом. Пунктирная линия представляет собой геномную последовательность, не включенную в нацеливающий вектор. Наборы аллель-специфических ПЦР-праймеров для генотипирования аллеля дикого типа обозначены противоположными стрелками (8010/PT5 и 4714/rN374).Зонд PB3/4 использовали для идентификации положительных клонов ES в Саузерн-блотах геномной ДНК, расщепленной с помощью Eco RV (E). ( B ) Нацеленный вектор P448L. Длинное плечо (LA) и короткое плечо (SA) представлены двойными стрелками. Кассета, устойчивая к неомицину (Neo r ), была встроена в 5′-конец кодирующей последовательности FKRP и фланкирована двумя сайтами узнавания loxP и FRT (открытые стрелки). Звездочка в экзоне 3 обозначает миссенс-мутацию P448L. ( C ) Целевой аллель P448L после гомологичной рекомбинации.Наборы аллель-специфических ПЦР-праймеров для генотипирования аллеля P448L обозначены противоположными стрелками (F3/PT5 и A1/UNI). Обратите внимание на наличие новой площадки Eco RV (E) в кассете Neo r . ( D ) Вектор наведения E310del. Звездочка в экзоне 3 обозначает укороченную делецию Е310, в которой была удалена кодирующая последовательность FKRP после аминокислоты Е310. Кассета Neo r с флоксом была вставлена ​​на 3′ оставшейся кодирующей последовательности FKRP. ( E ) Аллель-мишень E310del после гомологичной рекомбинации.Аллель-специфический набор праймеров для ПЦР для генотипирования аллеля E310del обозначен противоположными стрелками (4714/Neo1).

Мыши с делецией FKRP были созданы путем удаления кодирующей FKRP последовательности от аминокислоты E310 до стоп-кодона TGA в векторе-мишени (рис. 1D–E). С-конец FKRP содержит консенсусный мотив DxD, обычно встречающийся в других гликозилтрансферазах. Поскольку этот мотив обычно считается критическим для функции белков, мы ожидаем, что делеция С-конца FKRP приведет к потере функции белка.Функционально нокаутная гомозигота обозначается как E310del/E310del.

FKRP-нулевые мыши являются эмбриональными летальными

гетерозиготных мыши E310del/wt были фертильными и фенотипически нормальными, судя по визуальному осмотру и гистологии мышц. Вестерн-блоттинг показал, что уровни функционального гликозилирования α-DG в гетерозиготных мышцах были аналогичны таковым в мышцах дикого типа (данные не представлены). Однако нам не удалось получить гомозиготных мутантов путем скрещивания гетерозиготных мышей (таблица 1, E310del/E310del).Анализ генотипа эмбрионов на разных стадиях показал, что гомозиготная мутация E310del вызывает раннюю эмбриональную летальность (дополнительный материал, рис. S1D и таблица 1, E310del/E310del).

Таблица 1.

Генотип анализ потомства от гетерозиготных родителей

A AGE # Embryos
    2 #
    2 8
    2 29
      2 10
        2 11
          2 8
    2 10
    2 E105
    2 E12.59
      2 6
9 102 0
    2
4 P448L / P448L B
    2 79: 74
31

4 (13)

    2
    2 P448L/E310del c  
    2 P448L / WT
      2 E310DEL / WT
        2 Mutant

4

WT HET
    2 Mutant
Е7.5 31 7 7
29
E9.5 0
    2 9
1
7 3 4
    2 4
      2 0
1 5
    2 0
Взрослые
11 13 0
Генотипы
Нет.женщин: нет. Из мужчин WT Het Mutant
47 (2) 93 (3)
  Генотипы
Количество самок: нет. MEDES WT / WT
23: 15
    2 12
12 12 3 (2)
    2 E310DEL / E310DEL
A
    2
      2
# EMBRYOS
    2 8
    2 29
      2 10
        2 11
          2 8
    2 10
    2 E105
    2 E12.59
      2 6
9 102 0
    2
4 P448L / P448L B
    2 79: 74
31

4 (13)

    2
    2 P448L/E310del c  
    2 E310DEL / WT
      2 Mutant
    2 12
AGE
AGE
WT
    2 Mutant
E7.5 31 7 7
29
E9.5 0
    2 9
1
7 3 4
    2 4
      2 0
1 5
    2 0
Взрослые
11 13 0
Генотипы
Нет.женщин: нет. Из мужчин WT Het Mutant
47 (2) 93 (3)
  Генотипы
Количество самок: нет. MEDES WT / WT P448L / WT
23: 15 12 12 3 (2)
Таблица 1 .

Генотип анализ потомства от гетерозиготных родителей

    2 8
    2 E8.5
    2 10
    2 8
    2 1
    2 E105
      2 7
        2 7
          2 3
            2 4
              2 0
    2 6
      2 1
        2 5
    2 13
      2 0
    2

    4 P448L / P448L

    5 B B

      2
    2 79: 74
31

4 (13)

    2
    2 P448L/E310del c  
    2 P448L / WT
      2 E310DEL / WT
        2 Mutant
E310del / E310del а генотипов
Возраст # Эмбрионы WT хет мутантный
E7. 5 31 7 7 16
29 11
E9.5 10 0 9
E12.55 0
Взрослые 24 11
Генотипы
Нет.женщин: нет. Из мужчин WT Het Mutant
47 (2) 93 (3)
  Генотипы
Количество самок: нет. MEDES WT / WT
23: 15
    2 12
12 12 3 (2)
    2 E310DEL / E310DEL
A
    2
      2
# EMBRYOS
    2 8
    2 29
      2 10
        2 11
          2 8
    2 10
    2 E105
    2 E12.59
      2 6
9 102 0
    2
4 P448L / P448L B
    2 79: 74
31

4 (13)

    2
    2 P448L/E310del c  
    2 E310DEL / WT
      2 Мутант
0
AGE
AGE
WT
    2 Mutant
E7.5 31 7 7
29
E9.5 0
    2 9
1
7 3 4
    2 4
      2 0
1 5
    2 0
Взрослые
11 13 0
Генотипы
Нет.женщин: нет. Из мужчин WT Het Mutant
47 (2) 93 (3)
  Генотипы
Количество самок: нет. MEDES WT / WT P448L / WT
23: 15
    2 12
      2 12
        2 12
          2 12
            2 3 (2)

фенотипы гомозиготных мышей с нокаутом FKRP-neo-P448L

гетерозиготных мышей FKRP-neo-P448L/wt не показали явных физических или поведенческих отклонений по сравнению с мышами дикого типа.Количество гомозиготных мутантных мышей FKRP-neo-P448L, рожденных от спаривания гетерозиготных родителей, примерно соответствовало менделевскому соотношению (таблица 1, P448L/P448L). Однако примерно треть мутантных мышей погибла при рождении или в течение 2 дней. Остальные животные выжили более 6 месяцев. Мутантные мыши были заметно меньше своих братьев и сестер дикого типа и гетерозигот при рождении и оставались примерно на 20% меньше по весу ( P = 0,0002) на протяжении всей взрослой жизни (рис. 2А и дополнительный материал, рис.С2). Мышечная слабость стала очевидной у мутантных мышей уже через 2 недели и была продемонстрирована аномальным втягиванием задних конечностей, когда мышей подвешивали за хвосты (рис. 2B и C). Дистрофические фенотипы в мышцах соответствовали повышенным уровням креатинкиназы в сыворотке (КК) у мутантных мышей и примерно в 10 раз (8260 единиц/л, P = 0,0024) выше, чем у контрольной группы дикого типа (770 единиц/л). Материал, рис. S3). Уровни аланинтрансаминазы (АЛТ) также были значительно выше у мутантных мышей.Результаты анализов азота мочевины крови (BUN), щелочной фосфатазы (ALP) и холестерина не выявили существенных различий между мутантными однопометниками и однопометниками дикого типа. Другой заметной физической аномалией более чем у половины мутантных мышей была деформация черепа, связанная с увеличенным черепом и выпячиванием наружу теменной кости (рис. 2D и E). Полное исследование головного мозга выявило образование расширенных боковых желудочков, заполненных спинномозговой жидкостью, что свидетельствовало о том, что животные страдали гидроцефалией.Другие кости скелета оказались нормальными, судя по визуальному осмотру и рентгену. У гомозиготных мутантных мышей FKRP-neo-P448L также развились аномалии глаз в возрасте 3–4 недель. Размер двух глаз варьировался (рис. 2F), при этом в пораженном глазу наблюдалось помутнение, что свидетельствует о помутнении роговицы. Глазная и мозговая аномалия, по-видимому, не прогрессировала дальше по мере старения мышей.

Рисунок 2.

Фенотипы мутантных мышей FKRP-neo-P448L. ( A ) Мутантная мышь в возрасте 12 недель была заметно меньше, чем однопометная мышь дикого типа (wt) того же возраста.( B и C ) Мутантная мышь FKRP-neo-P448L демонстрировала сжатие задних конечностей, как только ее подвешивали за хвост. ( D и E ) Цифровые рентгеновские снимки, показывающие увеличенный и деформированный череп мыши-мутанта. Мыши дикого типа (D) и мутантные мыши (E) были 10-недельными самцами. ( F ) Аномалия глаза у 14-недельной мутантной мыши FKRP-neo-P448L. Обратите внимание на разницу в размерах двух глаз. Пораженные глаза обычно были крупнее. ( G ) Относительная экспрессия FKRP у мышей дикого типа (wt, n = 4), гетерозиготных (het, n = 6) и гомозиготных FKRP-neo-P448L (P448L, n = 6) по данным количественный анализ ОТ-ПЦР.Количество проанализированных мышей обозначено как n . Уровни снижения экспрессии FKRP были почти одинаковыми в четырехглавой мышце, икроножной мышце и сердце, и отдельные результаты, полученные для каждой ткани, были объединены, чтобы отразить общие изменения экспрессии FKRP среди генотипов. Экспрессию FKRP у мышей дикого типа нормализовали до 1. Статистически значимые изменения ( P = 0,02) получены только между мышами дикого типа и мутантными мышами. ( H ) Экспрессия FKRP в икроножной мышце, сердце и четырехглавой мышце.Все три генотипа показали примерно 3-4-кратное увеличение экспрессии FKRP в сердце по сравнению со скелетными мышцами. График был сведен в таблицу из объединенных результатов для мышей дикого типа и гетерозиготных мышей, демонстрирующих относительно более высокие уровни мРНК FKRP в сердце ( P <0,005). Десять и шесть животных были проанализированы на экспрессию FKRP в икроножной мышце/сердце и четырехглавой мышце, соответственно ( I ). Экспрессия FKRP в мышцах и сердце 5-15-недельных мышей. График был сведен в таблицу из объединенных результатов мышей дикого типа ( n = 4) и гетерозиготных мышей ( n = 6).Обратите внимание, что экспрессия FKRP как в икроножной мышце, так и в сердце имела сходную тенденцию к снижению с течением времени. Объединенные данные имеют значение P <0,05. Столбики погрешностей представляют собой среднее значение + SEM.

Рисунок 2.

Фенотипы мутантных мышей FKRP-neo-P448L. ( A ) Мутантная мышь в возрасте 12 недель была заметно меньше, чем однопометная мышь дикого типа (wt) того же возраста. ( B и C ) Мутантная мышь FKRP-neo-P448L демонстрировала сжатие задних конечностей, как только ее подвешивали за хвост.( D и E ) Цифровые рентгеновские снимки, показывающие увеличенный и деформированный череп мыши-мутанта. Мыши дикого типа (D) и мутантные мыши (E) были 10-недельными самцами. ( F ) Аномалия глаза у 14-недельной мутантной мыши FKRP-neo-P448L. Обратите внимание на разницу в размерах двух глаз. Пораженные глаза обычно были крупнее. ( G ) Относительная экспрессия FKRP у мышей дикого типа (wt, n = 4), гетерозиготных (het, n = 6) и гомозиготных FKRP-neo-P448L (P448L, n = 6) по данным количественный анализ ОТ-ПЦР.Количество проанализированных мышей обозначено как n . Уровни снижения экспрессии FKRP были почти одинаковыми в четырехглавой мышце, икроножной мышце и сердце, и отдельные результаты, полученные для каждой ткани, были объединены, чтобы отразить общие изменения экспрессии FKRP среди генотипов. Экспрессию FKRP у мышей дикого типа нормализовали до 1. Статистически значимые изменения ( P = 0,02) получены только между мышами дикого типа и мутантными мышами. ( H ) Экспрессия FKRP в икроножной мышце, сердце и четырехглавой мышце.Все три генотипа показали примерно 3-4-кратное увеличение экспрессии FKRP в сердце по сравнению со скелетными мышцами. График был сведен в таблицу из объединенных результатов для мышей дикого типа и гетерозиготных мышей, демонстрирующих относительно более высокие уровни мРНК FKRP в сердце ( P <0,005). Десять и шесть животных были проанализированы на экспрессию FKRP в икроножной мышце/сердце и четырехглавой мышце, соответственно ( I ). Экспрессия FKRP в мышцах и сердце 5-15-недельных мышей. График был сведен в таблицу из объединенных результатов мышей дикого типа ( n = 4) и гетерозиготных мышей ( n = 6).Обратите внимание, что экспрессия FKRP как в икроножной мышце, так и в сердце имела сходную тенденцию к снижению с течением времени. Объединенные данные имеют значение P <0,05. Столбики погрешностей представляют собой среднее значение + SEM.

Уровни транскриптов FKRP снижаются у мутантных мышей и варьируют в зависимости от тканей и возраста

Присутствие кассеты Neo r может влиять на экспрессию гена-мишени, а уровень экспрессии гена может влиять на тяжесть/фенотип заболевания (46).Поскольку обнаружить эндогенный белок FKRP сложно (43), мы провели количественную ПЦР в реальном времени для оценки экспрессии FKRP у мутантных животных с использованием РНК, выделенных из четырехглавой мышцы, икроножной мышцы и сердца. Результаты показали, что уровни транскриптов FKRP у мутантных мышей FKRP-neo-P448L были снижены примерно на 55% ( P = 0,02) по сравнению с контрольной группой дикого типа (рис. 2G, дополнительный материал, рис. С4). С другой стороны, экспрессия других генов, вовлеченных в дисстрогликанопатии, таких как фукутин , LARGE и дисстрогликан , у мутантных животных существенно не менялась.Сравнение экспрессии FKRP в разных тканях показало, что уровни мРНК FKRP в сердце были примерно в 3 раза выше, чем в скелетных мышцах (рис. 2H, P <0,005, дополнительный материал, рис. S4). Кроме того, экспрессия FKRP значительно снизилась с течением времени между 5 и 15 неделями во всех трех исследованных тканях (рис. 2I, P <0,05). В совокупности данные об экспрессии предполагают, что ген FKRP подвергается сложной регуляции во время развития и старения.

Дистрофическая патология скелетных мышц мышей с мутацией FKRP-neo-P448L

У новорожденных мышей с мутацией FKRP-neo-P448L, умерших при рождении или сразу после рождения, не было выявлено явных патологических изменений в скелетных мышцах, сердце и диафрагме (дополнительный материал, рис. S5). Однако при исследовании мутантных мышей в возрасте 5 недель и старше характерные признаки мышечной дистрофии проявлялись во всех скелетных мышцах, включая переднюю большеберцовую, четырехглавую, икроножную, межреберные, двуглавую и диафрагму (рис.3А). Патологические изменения включали вариации размеров волокон и наличие групп некротических волокон (звездочки) и центральных ядер (стрелка), что указывает на дегенерацию и регенерацию мышц. Эти признаки дегенерации и регенерации были видны почти на всех поперечных срезах мышц, но мы также обнаружили очаговые участки с волокнами относительно нормального размера и без интернализованных ядер и некрозов. Инфильтрация мононуклеарными клетками (стрелка) и расширение интерстициального пространства отчетливо наблюдались только в участках с большим количеством некротических волокон.Фиброз не был очевиден в мышцах мутантных мышей в возрасте 5 недель, но стал очевидным в возрасте 10 недель и старше, как показано окрашиванием трихромом (дополнительный материал, рис. S6). Дегенерация мышечных волокон, воспалительная инфильтрация и увеличение фиброзной ткани в целом были более выражены в диафрагме. Напротив, окрашивание H&E и трихромом не выявило дистрофических фенотипов в сердце мышей FKRP-neo-P448L в возрасте до 10 месяцев (рис. 3A). Почки и печень не пострадали при гистологическом исследовании, и это было подтверждено нормальными уровнями ЩФ и АМК в сыворотке (дополнительный материал, рис.С3). Никаких патологических изменений в мышцах дикого типа или гетерозиготных однопометников не наблюдалось.

Рисунок 3.

( A ) Окрашивание H&E различных тканей мышей дикого типа (wt, левый столбец), гетерозиготных (het, средний столбец) и гомозиготных мышей FKRP-neo-P448L (правый столбец). Ткани, показанные на рисунке (в каждом ряду), представляли собой четырехглавую мышцу, переднюю большеберцовую мышцу (TA), диафрагму, сердце и почку, взятые у 10-недельных самцов. Обратите внимание на наличие некротических волокон (звездочка), центральных ядер (стрелка) и инфильтрации мононуклеарных клеток (стрелка) в скелетных мышцах мутантных мышей FKRP-neo-P448L.Пруток, 200 мкм. ( B ) Ультраструктурный анализ скелетных мышц FKRP-neo-P448L. Четырехглавые мышцы 5-недельных мышей дикого типа (левый столбец) и мышей с мутацией FKRP-neo-P448L (правый столбец) исследовали с помощью электронной микроскопии. Увеличенные митохондрии в мышце FKRP-neo-P448L представлены звездочками. Обратите внимание, что вакуоли (обозначенные звездочками) под плазматической мембраной часто находятся вблизи других митохондрий. Стрелка указывает на разрушенную область в электронно-плотной сарколемме.Бар, 1 мкм на верхней панели; 200 нм на нижней панели.

Рисунок 3.

( A ) Окрашивание H&E различных тканей мышей дикого типа (wt, левый столбец), гетерозиготных (het, средний столбец) и гомозиготных мышей FKRP-neo-P448L (правый столбец). Ткани, показанные на рисунке (в каждом ряду), представляли собой четырехглавую мышцу, переднюю большеберцовую мышцу (TA), диафрагму, сердце и почку, взятые у 10-недельных самцов. Обратите внимание на наличие некротических волокон (звездочка), центральных ядер (стрелка) и инфильтрации мононуклеарных клеток (стрелка) в скелетных мышцах мутантных мышей FKRP-neo-P448L.Пруток, 200 мкм. ( B ) Ультраструктурный анализ скелетных мышц FKRP-neo-P448L. Четырехглавые мышцы 5-недельных мышей дикого типа (левый столбец) и мышей с мутацией FKRP-neo-P448L (правый столбец) исследовали с помощью электронной микроскопии. Увеличенные митохондрии в мышце FKRP-neo-P448L представлены звездочками. Обратите внимание, что вакуоли (обозначенные звездочками) под плазматической мембраной часто находятся вблизи других митохондрий. Стрелка указывает на разрушенную область в электронно-плотной сарколемме.Бар, 1 мкм на верхней панели; 200 нм на нижней панели.

Ультраструктурный анализ четырехглавой мышцы бедра мутантных мышей FKRP-neo-P448L показал увеличение митохондрий (рис. 3B, звездочки). Это согласуется с предыдущими сообщениями о том, что наличие набухших митохондрий может представлять собой вторичный ответ на дегенерацию мышц при других мышечных заболеваниях (47). Мы также наблюдали значительное количество дегенерирующих вакуолей, особенно под сарколеммой (рис. 3B, звездочки). Кроме того, сарколемма оказалась менее однородной в мутантных мышечных волокнах.Некоторые области вдоль сарколеммы были прерывистыми и не имели плазматической мембраны (стрелка). Электронно-микроскопические данные, согласующиеся с повышенным уровнем CK в сыворотке, позволили предположить основной дефект мышечной мембраны мышей FKRP-neo-P448L.

Потеря функционального гликозилирования α-DG у мышей с мутацией FKRP-neo-P448L

Ввиду предполагаемой функции FKRP в гликозилировании α-DG мы исследовали мышечные ткани мышей с мутацией FKRP-neo-P448L с моноклональными антителами IIH6C4 и VIA4-1.Эти два антитела обнаруживают неопределенные гликоэпитопы α-DG. Эпитоп(ы) также перекрывается с сайтом связывания ламинина на белке α-DG (2). Вестерн-блоттинг выявил почти полное отсутствие сигналов IIH6C4 и VIA4-1 как в скелетных, так и в сердечных мышцах (рис. 4А и В). Ламинин-связывающая активность α-DG также была почти устранена в мутантных скелетных и сердечных мышцах, что продемонстрировано анализом наложения ламинина (рис. 4A и D). Это отличалось от нормального функционального гликозилирования α-DG в мышцах однопометных животных дикого типа и гетерозигот.Стационарные уровни α-DG у мышей с мутацией FKRP-neo-P448L не изменились по сравнению с диким типом и гетерозиготным контролем, судя по двум различным антителам против α-DG (α-DG и DAG-1). (Рис. 4А). Поскольку и α-DG, и β-DG посттрансляционно отщепляются от одного полипептида, эти результаты согласуются с представлением о том, что FKRP в первую очередь влияет на гликозилирование α-DG, но не на уровни белка.

Рисунок 4.

Вестерн-блоттинг и наложение ламинина на скелетные мышцы, сердце и мозг мышей с мутацией FKRP-neo-P448L.( A ) Были проанализированы четырехглавые мышцы четырех мышей дикого типа (дорожка W), шести гетерозиготных (дорожка H) и шести мутантных мышей FKRP-neo-P448L (дорожка M) в возрасте 5–15 недель. Иммунореактивность антител IIH6C4 и VIA4-1 и ламинин-связывающая активность в отношении α-DG были значительно снижены в мутантной мышце. Уровни β-DG оценивали как с помощью антител β-DG (DSHB), так и DAG-1 (Sigma). Обратите внимание на драматическую активацию β 1 -интегрина в мутантной мышце. Другие скелетные мышцы, включая TA, икроножную и диафрагму, также были проанализированы с идентичными результатами.Антитела, использованные в вестерн-блоттинге, перечислены в дополнительном материале, таблица S1. ( B ) Вестерн-блоты сердца. ( C ) Вестерн-блоты головного мозга. Обратите внимание, что две полосы, показанные в пятне дистрофина, представляют дистрофин полной длины и его изоформу мозга Dp140. ( D и E ) Анализ наложения ламинина сердца и головного мозга соответственно.

Рисунок 4.

Вестерн-блоттинг и наложение ламинина на скелетные мышцы, сердце и мозг мышей с мутацией FKRP-neo-P448L.( A ) Были проанализированы четырехглавые мышцы четырех мышей дикого типа (дорожка W), шести гетерозиготных (дорожка H) и шести мутантных мышей FKRP-neo-P448L (дорожка M) в возрасте 5–15 недель. Иммунореактивность антител IIH6C4 и VIA4-1 и ламинин-связывающая активность в отношении α-DG были значительно снижены в мутантной мышце. Уровни β-DG оценивали как с помощью антител β-DG (DSHB), так и DAG-1 (Sigma). Обратите внимание на драматическую активацию β 1 -интегрина в мутантной мышце. Другие скелетные мышцы, включая TA, икроножную и диафрагму, также были проанализированы с идентичными результатами.Антитела, использованные в вестерн-блоттинге, перечислены в дополнительном материале, таблица S1. ( B ) Вестерн-блоты сердца. ( C ) Вестерн-блоты головного мозга. Обратите внимание, что две полосы, показанные в пятне дистрофина, представляют дистрофин полной длины и его изоформу мозга Dp140. ( D и E ) Анализ наложения ламинина сердца и головного мозга соответственно.

Отсутствие функционального гликозилирования α-DG было подтверждено иммунофлуоресцентными исследованиями. Иммуномечение антителами IIH6C4 и VIA4-1 отсутствовало во всех мышцах мутантных мышей FKRP-neo-P448L (рис.5 и дополнительный материал, рис. S7). Однако мы не наблюдали снижения окрашивания ламинина α2 в мутантных мышцах (рис. 5). Окрашивание β-DG и дистрофина в мутантных мышцах было нормальным. Были обнаружены группы волокон с сильными сигналами, покрывающими все поперечное сечение волокна, что указывает на серьезную утечку мембраны с циркулирующими IgG внутри дегенерирующих волокон (рис. 5, наконечник стрелки). Это наблюдение подтверждает открытие EM, что сарколеммальная структура нарушена в мутантных мышцах.

Рисунок 5.

Иммунофлуоресцентные изображения мышц дикого типа (wt, левый столбец), гетерозиготных (het, средний столбец) и мутантных мышц FKRP-neo-P448L (правый столбец). Ткани, показанные на рисунке (в каждом ряду), представляли собой сердце, четырехглавую мышцу и диафрагму, взятые у 12-недельных мышей. Иммуноокрашивание антителами IIH6C4 полностью отсутствовало в мутантной мышце. Стрелка указывает на дегенеративные волокна, окрашенные козьим антимышиным Ig Alexa594. Напротив, интенсивность мечения ламинина α2 в мутантной мышце FKRP-neo-P448L была нормальной и однородной на сарколемме по сравнению с мышцами дикого типа и гетерозиготными.Мелкие волокна и центральное зародышеобразование (синие пятна, окрашивание DAPI) были четко видны в мутантной мышце FKRP-neo-P448L. Пруток, 50 мкм.

Рисунок 5.

Иммунофлуоресцентные изображения мышц дикого типа (wt, левый столбец), гетерозиготных (het, средний столбец) и мутантной мышцы FKRP-neo-P448L (правый столбец). Ткани, показанные на рисунке (в каждом ряду), представляли собой сердце, четырехглавую мышцу и диафрагму, взятые у 12-недельных мышей. Иммуноокрашивание антителами IIH6C4 полностью отсутствовало в мутантной мышце.Стрелка указывает на дегенеративные волокна, окрашенные козьим антимышиным Ig Alexa594. Напротив, интенсивность мечения ламинина α2 в мутантной мышце FKRP-neo-P448L была нормальной и однородной на сарколемме по сравнению с мышцами дикого типа и гетерозиготными. Мелкие волокна и центральное зародышеобразование (синие пятна, окрашивание DAPI) были четко видны в мутантной мышце FKRP-neo-P448L. Пруток, 50 мкм.

Учитывая критическую роль DGC при мышечных дистрофиях, мы также сравнили экспрессию дистрофина, дисферлина и дистробревина среди трех генотипов и не обнаружили явных изменений в уровне их белка (рис.4А). С другой стороны, мы наблюдали резкое усиление (более чем в 10 раз) β 1 -интегрина в скелетных мышцах, но не в сердце мутантных мышей (рис. 4A и дополнительный материал, рис. S8). Поскольку экспрессия laminin α2 не была затронута у мутантных мышей FKRP-neo-P448L, повышенные уровни β 1 -интегрина могут компенсировать недостаток функциональных DGC, как предположили Kaufman и его коллеги (48–50). Кроме того, вестерн-блот-анализ экстрактов головного мозга также показал, что α-DG был аберрантно гликозилирован у мышей FKRP-neo-P448L (фиг.4С). Иммунореактивность антител IIH6C4 и VIA4-1 и активность связывания ламинина почти отсутствовали во всех мутантных мозгах, как и в мышцах (рис. 4E).

Мыши с мутацией FKRP-neo-P448L обнаруживают множественные дефекты развития ЦНС

Поскольку у пациентов с дистрогликанопатией с тяжелым фенотипом обнаруживаются отчетливые аномалии ЦНС, мы проанализировали мозг мутантных мышей FKRP-neo-P448L. При визуальном осмотре в головном мозге мутантных мышей были отмечены грубые структурные аномалии в возрасте от новорожденных до 15-недельного возраста (рис.6А). Поверхность мозга мутантов имела более гладкий вид, напоминающий лиссэнцефалию типа булыжника II (пять из шести исследованных). Внешний вид ствола мозга был аномальным и не имел типичной удлиненной структуры, что согласуется с данными МРТ у пациентов с тяжелой дисгликанопатией (51). Гидроцефалия также была обычным признаком мутантных мышей (четыре из шести исследованных).

Рисунок 6.

( A ) Стереоизображения мозга дикого типа (wt) и мутанта FKRP-neo-P448L.Поверхность нормального мозга была покрыта складками и бороздками. Напротив, мозг 7-недельной мутантной мыши FKRP-neo-P448L имел более гладкую поверхность со скрытой продольной трещиной. Стрелки указывают на коллапс коры после забора жидкости из увеличенных боковых желудочков (см. B). ( B ) Корональные срезы головного мозга дикого типа (wt) и мутанта FKRP-neo-P448L окрашивали H&E. Грубый архитектор мозжечка дезорганизован в мутантном мозгу. Обратите внимание на слияние межполушарной щели (стрелка) и увеличенные боковые желудочки (звездочка).( C ) Сагиттальные срезы коры головного мозга 7-недельной мутантной мыши FKRP-neo-P448L окрашивали крезиловым фиолетовым. Слои MLI в мозгу людей дикого типа и гетерозигот (гетерозигот) соответствующего возраста легко отличались от слоев MLII, они содержали меньше нейронов и казались менее плотными. Обратите внимание на размытую границу между слоями MLI и II в мутантном мозге. ( D ) Сагиттальные срезы мозжечка мышей дикого типа и мутантных мышей FKRP-neo-P448L (1, 5 недель; 2, 14 недель) окрашивали крезиловым фиолетовым.Стрелка указывает на наличие гранулярных нейронов между двумя соседними листками. Обратите внимание, что мозжечковые дольки были слиты у мутантных мышей. ( E ) Сагиттальные срезы гиппокампа мышей дикого типа и мутантных мышей FKRP-neo-P448L (P448L 3, 5 недель) окрашивали крезиловым фиолетовым. В гиппокампе мутантных мышей были обнаружены лишь незначительные аномалии. Обратите внимание на волнистую структуру зубчатой ​​извилины мутантных мышей в возрасте 15 недель (P448L 4).

Рисунок 6.

( A ) Стереоизображения мозга дикого типа (wt) и мутанта FKRP-neo-P448L.Поверхность нормального мозга была покрыта складками и бороздками. Напротив, мозг 7-недельной мутантной мыши FKRP-neo-P448L имел более гладкую поверхность со скрытой продольной трещиной. Стрелки указывают на коллапс коры после забора жидкости из увеличенных боковых желудочков (см. B). ( B ) Корональные срезы головного мозга дикого типа (wt) и мутанта FKRP-neo-P448L окрашивали H&E. Грубый архитектор мозжечка дезорганизован в мутантном мозгу. Обратите внимание на слияние межполушарной щели (стрелка) и увеличенные боковые желудочки (звездочка).( C ) Сагиттальные срезы коры головного мозга 7-недельной мутантной мыши FKRP-neo-P448L окрашивали крезиловым фиолетовым. Слои MLI в мозгу людей дикого типа и гетерозигот (гетерозигот) соответствующего возраста легко отличались от слоев MLII, они содержали меньше нейронов и казались менее плотными. Обратите внимание на размытую границу между слоями MLI и II в мутантном мозге. ( D ) Сагиттальные срезы мозжечка мышей дикого типа и мутантных мышей FKRP-neo-P448L (1, 5 недель; 2, 14 недель) окрашивали крезиловым фиолетовым.Стрелка указывает на наличие гранулярных нейронов между двумя соседними листками. Обратите внимание, что мозжечковые дольки были слиты у мутантных мышей. ( E ) Сагиттальные срезы гиппокампа мышей дикого типа и мутантных мышей FKRP-neo-P448L (P448L 3, 5 недель) окрашивали крезиловым фиолетовым. В гиппокампе мутантных мышей были обнаружены лишь незначительные аномалии. Обратите внимание на волнистую структуру зубчатой ​​извилины мутантных мышей в возрасте 15 недель (P448L 4).

Гистологические исследования выявили характерные признаки аномальной миграции нейронов в коре головного мозга мышей с мутацией FKRP-neo-P448L.Межполушарная щель срослась, что характерно для полимикрогирии человека (рис. 6B, наконечник стрелки). Боковые желудочки расширились (звездочки), что свидетельствует о наличии гидроцефалии. Кортикальные ламинарные структуры были дезорганизованы таким образом, что граница между молекулярными слоями I (MLI) и MLII была постоянно затемнена в большинстве исследованных мутантных мозгов (рис. 6C), хотя также существовали области, которые, по-видимому, имели нормальную ламинарную организацию. Все однопометники дикого типа и гетерозиготные имели нормальную цитоархитектонику.

Структурные дефекты мозжечка были заметными у мышей FKRP-neo-P448L (шесть исследованных) и соответствовали дефектам миграции нейронов (рис. 6B). Архитектура листков мозжечка была сильно искажена и частично срослась (рис. 6D). Нейроны из зернистого слоя часто образовывали скопления в субплиальных слоях между двумя соседними листками (стрелка). Этот результат согласуется с недавними исследованиями МРТ, показывающими, что эта часть мозга очень чувствительна к изменениям при мышечных дистрофиях, связанных с FKRP (51).Гиппокамп, по-видимому, умеренно поражен у некоторых старых мутантных мышей. Часть зубчатой ​​извилины была дублирована и неправильно свернута в типичный V-образный слой, как сообщалось в других моделях животных (рис. 6E; 52–54). Однако нормальная архитектура гиппокампа наблюдалась у трех из шести исследованных мутантных животных.

Гистологический анализ также выявил структурные аномалии в глазах мышей с мутацией FKRP-neo-P448L, свидетельствующие о гипотрофии. Сетчатка обычно организована в отдельные слои, но у мутантных мышей она нарушена (рис.7А). Как внешний ядерный слой (ONL), так и внутренний ядерный слой (INL) у мутантных мышей были тоньше, чем у мышей дикого типа или гетерозигот. Слой ганглиозных клеток (ГКЛ) и внутренняя пограничная мембрана были разрушены в присутствии эктопических клеток вне мембраны. Зрительные нервы, как правило, были меньше у мутантных мышей, а клеточные компоненты были явно дезорганизованы вблизи сетчатки (рис. 7B).

Рисунок 7.

Аномалии глаз у мышей с мутацией FKRP-neo-P448L.( A ) Порок развития сетчатки у мутантных мышей в возрасте 5 недель. Внутренний (INL) и внешний (ONL) ядерные слои были тоньше, чем в контрольном глазу. Слой ганглиозных клеток (GCL) и внутренняя пограничная мембрана (красная) были сильно дезорганизованы. Нижнее изображение сетчатки мыши FKRP-neo-P448L было получено из области вблизи зрительного нерва. ( B ) Зрительный нерв возле сетчатки. Диск зрительного нерва был дезорганизован у мышей с мутацией FKRP-neo-P448L.

Рисунок 7.

Аномалии глаз у мышей с мутацией FKRP-neo-P448L.( A ) Порок развития сетчатки у мутантных мышей в возрасте 5 недель. Внутренний (INL) и внешний (ONL) ядерные слои были тоньше, чем в контрольном глазу. Слой ганглиозных клеток (GCL) и внутренняя пограничная мембрана (красная) были сильно дезорганизованы. Нижнее изображение сетчатки мыши FKRP-neo-P448L было получено из области вблизи зрительного нерва. ( B ) Зрительный нерв возле сетчатки. Диск зрительного нерва был дезорганизован у мышей с мутацией FKRP-neo-P448L.

ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из проблем понимания роли FKRP при мышечных дистрофиях является отсутствие подходящих моделей мышей.Здесь мы сообщаем о поколении двух моделей мышей FKRP. В то время как гомозиготные мыши с делецией FKRP вызывают эмбриональную летальность, гомозиготные мыши FKRP-neo-P448L жизнеспособны и вскоре после рождения у них развивается мышечная слабость и истощение. Патологические данные соответствуют тяжелой прогрессирующей дистрофии. Биохимический и иммунохимический анализы демонстрируют заметное снижение окрашивания α-DG с использованием гликан-специфических антител IIH6C4 и VIA4-1. Ламинин-связывающая активность α-DG также снижена до едва определяемого уровня как в мышцах, так и в мозге, что указывает на то, что α-DG функционально не гликозилирован.Целостность сарколеммы, по-видимому, нарушена, что подтверждается повышенным уровнем КФК в сыворотке и ультраструктурными исследованиями. Эти результаты согласуются с дестабилизированной связью из-за потери или уменьшения связывания α-DG с ламинином в ECM. Таким образом, наша экспериментальная модель животных подтверждает критическую роль FKRP в выживании и функционировании мышц и поддерживает текущую гипотезу о том, что FKRP участвует в посттрансляционных модификациях α-DG.

Мыши FKRP E310del несут делецию С-конца, включая консенсусный мотив DxD, который, как считается, отвечает за гликозилтрансферазную активность многих ферментов.Анализ генотипа показывает, что гомозиготные нулевые эмбрионы погибли до достижения E12.5. Недавние сообщения также документально подтвердили, что эмбрионы fukutin-null и POMT1-null не выживали после E9.5, указывая на функциональную связь между этими генами (55,56). Эффекты FKRP на развитие, вероятно, также опосредованы потерей α-DG гликозилирования у эмбрионов, т.к. Dag1-нуль-эмбрионы обнаруживают серьезные аномалии уже на стадии E6.5 (57). В совокупности эти находки указывают на то, что полная потеря белка/функции FKRP несовместима с выживанием и согласуется с наблюдениями о том, что гомозиготная мутация FKRP-null никогда не выявлялась у людей.Учитывая, что белки FKRP дикого типа и укороченные E310 одинаково хорошо секретировались в культуральную среду при экспрессии в клетках CHO (58), эти результаты позволяют предположить, что основные дефекты делеции E310, вероятно, были связаны с потерей важной функции, связанной с с С-концом FKRP, а не с измененным трафиком или локализацией.

В попытке модулировать тяжесть и фенотипы мышей FKRP мы создали сложные гетерозиготные мутации путем скрещивания гетерозиготных мышей FKRP-neo-P448/wt с гетерозиготными мышами E310del/wt.В отличие от гомозиготных мышей FKRP-neo-P448L, количество составных гетерозиготных мышей FKRP-neo-P448L/E310del не достигает менделевского распределения (таблица 1, P448L/E310del). Родилось всего несколько мышей-мутантов, и они умерли при рождении. Тяжелые фенотипы согласовывались с наблюдениями о том, что делеция E310 (эмбриональная летальность) более опасна, чем миссенс-мутация P448L (жизнеспособна), когда представлена ​​в гомозиготном состоянии. Другие линии доказательств также предполагают, что на тяжесть заболевания может влиять как сама мутация FKRP, так и уровень экспрессии.Экспрессия транскриптов FKRP как у мышей FKRP-neo-P448L, так и у мышей FKRP-Neo Y307N снижена примерно до половины уровней, присутствующих у мышей дикого типа, но все же приводит к различной степени тяжести (41). Кроме того, экспрессия FKRP у мышей, несущих гомозиготную миссенс-мутацию L276I (с кассетой Neo r ), также снижена примерно на 45%, но у животных нет явных фенотипов заболевания (Y. Chan, личное наблюдение). Ввиду этих результатов становится очевидным, что помимо уровней экспрессии FKRP природа мутаций также играет критическую роль в определении фенотипических вариаций различных моделей мышей с мутациями FKRP.Клинически мутации L276I и P448L связаны с относительно легким фенотипом LGMD2I (59) и тяжелым фенотипом MDC1C (28, 36) соответственно. Известно, что мутация Y307N вызывает MEB у человека (34, 60). Таким образом, корреляция между фенотипом и генотипом у этих трех линий мышей примерно соответствует аналогичной тенденции, параллельной для пациентов с соответствующими мутациями FKRP.

В этом исследовании мы обнаружили, что в ЦНС мутантных мышей FKRP-neo-P448L обнаруживаются поразительные аномалии, напоминающие некоторых пациентов с дистрогликанопатией человека.Первичные дефекты головного мозга включают лиссэнцефалию типа «булыжник» (тип II) и гидроцефалию. Слоистость и архитектура как коры головного мозга, так и мозжечка сильно дезорганизованы и характеризуются аномальной миграцией нейронов. Выраженные глазные дефекты и пороки развития сетчатки также характерны для мутантных мышей. Наблюдаются также структурные дефекты гиппокампа. Сходные патологические признаки также характерны для других животных моделей дисстрогликанопатии, включая FKRP-Neo Y307N , фукутиновую химеру, POMGnT1-null, LARGE myd и нулевых мышей MORE-DG (19, 41, 52–54).Взятые вместе, эти результаты дают убедительные доказательства того, что правильное гликозилирование α-DG необходимо для кортикогенеза и нормального развития глаз. Кроме того, патологическое сходство также подтверждает аргумент, что FKRP участвует с другими гликозилтрансферазами в общих путях, включающих модификацию α-DG.

Однако важность функционального гликозилирования α-DG в патогенезе мышечных дистрофий, связанных с FKRP, до конца не изучена. Предыдущие исследования показали, что уровни гликозилирования α-DG не всегда коррелируют с клинической тяжестью у пациентов с мутациями FKRP и fukutin (39), и значительное количество функционально гликозилированного α-DG может быть обнаружено как в LGMD2I, так и в тяжелые мышцы MDC1C (39,40).Чтобы добавить сложности, недавнее исследование Ackroyd et al. (41) сообщили, что мыши FKRP-Neo Y307N экспрессируют относительно много функционального α-DG, но животные умирали при рождении или вскоре после него. Напротив, функциональное гликозилирование α-DG едва обнаруживается во всех тканях у мутантных мышей FKRP-neo-P448L, но некоторые из них до настоящего времени выживали более 10 месяцев. Интересно, что, несмотря на потерю гликозилирования α-DG, сердце не подвергается патологическим изменениям у гомозиготных мышей с мутацией FKRP-neo-P448L, и это может способствовать их общей выживаемости.Взятые вместе, эти результаты предполагают, что FKRP может иметь другие неизвестные функции и что факторы, отличные от гликозилирования α-DG, также важны для модулирования тяжести заболевания. В поддержку этой точки зрения было обнаружено, что уровни экспрессии нескольких белков, которые, как известно, вызывают мышечные дистрофии, различаются между мутантными мышами FKRP-neo-P448L и другими моделями животных с дистрогликанопатией. Например, уровни и характер окрашивания α-2 ламинина не изменяются в мутантных мышцах FKRP-neo-P448L, в отличие от сниженной экспрессии, отмеченной у мышей FKRP-Neo Y307N и LARGE myd (41,54). .Уровни нескольких белков DGC повышены в скелетных мышцах мышей LARGE myd , но не у мышей с мутацией FKRP-neo-P448L. С др. стороны, β 1 -интегрин значительно активируется в мутантных мышцах FKRP-neo-P448L, но его уровни не изменяются в POMGnT1-нулевых миобластах (61). Таким образом, вполне вероятно, что разные вторичные пути могут быть активированы в ответ на природу мутации, тем самым частично внося свой вклад в общие фенотипы в каждой животной модели.Ясно, что эти наблюдения требуют дальнейшего изучения.

Таким образом, наша модель мыши с нокаутом FKRP развивает фенотипы мышц и ЦНС, сопровождающиеся серьезным снижением функционального гликозилирования α-DG, и резюмирует широкий клинический спектр, связанный с мутациями FKRP у пациентов с дистрогликанопатией. Мыши с нокаутом FKRP-neo-P448L, безусловно, пополняют растущий список животных моделей дисстрогликанопатий. Насколько нам известно, наши мутантные мыши FKRP-neo-P448L являются первой жизнеспособной моделью мышей, о которой сообщалось для связанных с FKRP мышечных дистрофий.В будущем станет возможным получение сложных гетерозиготных мутаций различной степени тяжести путем скрещивания мышей FKRP-neo-P448L с мышами, несущими другие мутации FKRP. Такие модели животных будут полезны для анализа молекулярных механизмов и разработки методов лечения, адаптированных к конкретным мутациям FKRP.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поколение моделей животных FKRP

нокаутированных мышей были получены лабораторией inGenious Targeting Laboratory (Стони-Брук, штат Нью-Йорк, США).Вектор-мишень (рис. 1B) был сконструирован с точечной мутацией c.1343C>T, что привело к замене аминокислоты с пролина на лейцин в положении 448. Кассета Neo r была помещена в интрон 2 примерно на 140 п.н. выше по течению. кодирующего экзона 3. Конструкция была разработана таким образом, что короткое гомологическое плечо (SA) простирается на 3 т.п.н. от кассеты Neo r , а длинное гомологическое плечо (LA) простирается на 4 т.п.о. 3′ до точечной мутации, введенной в экзон 3. Вектор-мишень электропорировали в эмбриональные стволовые клетки iTL BA1 (C57BL/6NX129/SvEv), а правильно нацеленные ES-клоны микроинъецировали в бластоцисты C57BL/6N для получения химерных мышей.Гетерозиготные мыши FKRP-neo-P448L/wt, передающиеся по зародышевой линии, были получены путем скрещивания самцов-химер с самками мышей C57BL/6N. Мыши с делецией FKRP были созданы с использованием аналогичных подходов в Лаборатории моделей животных Университета Северной Каролины, Чапел-Хилл. Кодирующая область от аминокислоты E310 до стоп-кодона TGA в положении 495 была удалена в нацеливающем векторе, а кассета Neo r была помещена в область 3′-UTR (рис. 1D). Все мыши содержались в виварии Медицинского центра Каролины в соответствии с рекомендациями института по уходу за животными.Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского центра Каролины.

Генотипирование мышей FKRP

Генотипы потомства от скрещивания гетерозиготных мышей FKRP-neo-P448L/wt определяли методом аллель-специфичной ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из хвостов мышей. Праймеры для амплификации аллеля дикого типа (рис. 1A) – 8010 (прямой): AGTGGTCTGTTTAGGGCAGG и PT5 (обратный): CCAAACTTCAGCTCCAGGAAG. Праймеры для амплификации целевого аллеля P448L (фиг.1C) — это F3 (вперед): GCATAAGCTTGGATCCGTTCTTCGGAC и PT5 (назад). Набор праймеров A1 (вперед): TGAGAGACTGAAGTGGTAACC; UNI (обратная сторона): AGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTC использовали для подтверждения правильной интеграции целевого аллеля P448L (рис. 1C). Для определения генотипов эмбрионов от скрещивания гетерозиготных мышей E310del/wt использовали следующие праймеры. Аллель дикого типа (рис. 1A): 4714 (прямой): GCTGACAACTTGCTCCACACTCCC и rN374 (обратный): TTGCCCACGTCCTCCAGGTA. Целевой аллель E310del (фиг.1E): 4714 (прямой) и neo1 (обратный), GAGAACCTGCGTGCAATCCA. Олигопраймеры были синтезированы IDT (Коралвилл, Айова, США). Секвенирование ДНК проводили на генетическом анализаторе 310 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) в Центре молекулярного ядра Каролинского медицинского центра.

Саузерн-блоттинг

Вторичное подтверждение положительных клонов эмбриональных стволовых клеток (ES) FKRP-neo-P448L, идентифицированных с помощью ПЦР, выполняли в соответствии со следующими процедурами.ДНК хвоста мыши расщепляли с помощью Eco RV и разделяли на 0,8% агарозном геле. После переноса на нейлоновую мембрану расщепленную ДНК гибридизовали с зондом длиной 442 п.н. (PB3/4), нацеленным на 5′-участок, внешний по отношению к нацеливающему вектору (рис. 1C). Зонд амплифицировали с помощью ПЦР-праймеров PB3 (прямой): ACTGCCTCTACGTAGGCAAAGG и PB4 (обратный): TCCTCTTAGAGGAATGTCTTTGGG. Благодаря наличию дополнительного сайта Eco RV в кассете Neo r после гомологичной рекомбинации зонд обнаруживает 7.Полоса 5 т.п.н. для целевого аллеля P448L вместо полосы 12 т.п.н. для аллеля дикого типа после расщепления Eco RV.

Количественный ПЦР-анализ

РНК из четырехглавой мышцы, икроножной мышцы и сердца выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и подвергали обратной транскрипции с помощью набора для синтеза кДНК iScript™ (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США). Количественную ПЦР проводили на системе быстрой ПЦР в реальном времени ABI Prism 7500 с использованием TaqMan ® Probe-Based Detection (Applied Biosystems).Образцы РНК обрабатывали ДНКазой, не содержащей РНКаз, перед добавлением анализов экспрессии генов Taqman ® и мастер-микса экспрессии генов Taqman ® . Зонд FKRP был специально разработан для амплификации фрагмента размером 73 п.н. из области экзона 3. Зонды фукутин (Mm00519882-m2), LARGE (Mm00521885-m1) и DG (Mm00802400-m1) были получены от Applied Biosystems. GAPDH (Mm03302249-g1) использовали в качестве внутреннего контроля. Все реакции проводили в трехкратной повторности. Данные были проанализированы с помощью RealTime StatMiner, версия 4.0 (Integromics, Филадельфия, Пенсильвания, США). Дисперсионный анализ проводился всякий раз, когда участвовало несколько факторов. В противном случае применялся тест t .

Гистологические и морфологические анализы

Скелетные мышцы и сердце были заморожены в изопентане, охлажденном жидким азотом. Из замороженных тканей вырезали срезы толщиной 6 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E), Ниссля (крезилвиолет) или трихромом. Мозг и мышцы мышей фиксировали в 10% формалине при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем заливали в парафин.Парафиновые блоки нарезают на серийные срезы толщиной 4 мкм в коронарной и сагиттальной ориентации. Изображения исследовали с помощью микроскопа Olympus BX51 (Center Valley, PA, USA). Снимки всего мозга были сделаны с использованием стереомикроскопа Olympus SZ61. Рентгеновские изображения скелета мыши были получены с использованием системы цифровой рентгенографии образцов PiXarray 100 (Bioptics, Тусон, Аризона, США).

Электронная микроскопия

Четырехглавая мышца

была рассечена на блоки по 3 мм и зафиксирована на 2 блока.5% глутарового альдегида (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) в 0,1 м фосфатном буфере Миллонига в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы пропитывали 1% осмиевой кислотой, обезвоживали в этаноле, а затем заливали смолой Spurr (Electron Microscopy Sciences). Ультратонкие срезы на медных сетках окрашивали 2% раствором уранилацетата и 0,3 мкм цитрата свинца и анализировали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа Philips CM-10, работающего при напряжении 60 кВ. Цифровые изображения были получены с помощью системы цифровых камер от 4pi Analysis (Дарем, Северная Каролина, США).

Статистический анализ

Описательные статистические данные, включая средние значения и стандартные отклонения, или количества и проценты, были рассчитаны для анализа массы тела и сыворотки крови. Для данных, измеренных по интервальной шкале, применяли дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим, при необходимости, тестом Турции. Если данные не были нормально распределены, использовался критерий Краскела-Уоллиса или критерий суммы рангов Уилкоксона. Для всех анализов использовали SAS ® версии 9.1.Двустороннее значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Антитела

Антитела, использованные в исследовании, перечислены в дополнительном материале, таблица S1.

Иммунофлуоресцентный анализ

Замороженные поперечные срезы мышц вырезали толщиной 6 мкм и блокировали 10% нормальной козьей сывороткой и 20% эмбриональной бычьей сывороткой, разведенной в фосфатно-солевом буфере (PBS) на 30 мин. Срезы инкубировали при комнатной температуре с первичными антителами IIH6C4 (1:200, ночь при 4°C), ламинином α2 (1:200, 1 ч), DAG-1 (1:2000, 1 ч) и дистрофином Р7 ( 1:500, 1 ч).Все антитела разводили в PBS, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки. Срезы тщательно промывали PBS, а затем инкубировали с конъюгированными с AlexaFluor 594 антимышиными или антикроличьими вторичными антителами (Molecular Probes/Invitrogen). Срезы также окрашивали вторичными антителами в качестве отрицательного контроля. Иммунофлуоресценцию визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии Olympus BX51. Изображения были сняты с помощью ПЗС-камеры Olympus DP70 при стандартном усилении и одинаковом времени экспозиции.

Экстракция белков и вестерн-блоттинг

Суммарные белки экстрагировали из представляющих интерес тканей с использованием буфера TX-100 (1% Triton X-100, 50 мМ Трис, pH 8.0, 150 мМ NaCl, 0,1% SDS) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Roche, Германия). Ткани гомогенизировали в буфере ТХ-100 и супернатанты собирали центрифугированием при 18 000 g в течение 15 мин. Затем лизаты пропускали через колонку для обессоливания Zeba (Pierce, Rockford, IL, USA) и наносили на гель с 4–20% трис-глицина (Invitrogen). Концентрацию белка определяли с помощью модифицированного анализа Лоури (анализ белка Bio-Rad DC). Для вестерн-блоттинга мембраны из поливинилидендифторида (ПВДФ) инкубировали с не содержащим белка блокирующим Т20 буфером (Pierce, Rockford, IL, USA).Первичные и вторичные антитела инкубировали в 20 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20 и 0,5% желатина в рекомендуемых концентрациях (дополнительный материал, таблица S1). Блоты проявляли с помощью ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), а изображения экспонировали и обрабатывали с помощью системы обработки изображений LAS-4000 (Fujifilm, Valhalla, NY, USA).

Анализ связывания ламинина

Белки

переносили на мембраны PVDF и инкубировали в течение 6 ч при 4°C в ламининовом буфере (10 мМ этаноламин, 140 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 и 1 мМ CaCl 2 , pH 7.4) содержащие 5% обезжиренного сухого молока. Зонд ламинина готовили путем конъюгации ламинина Engelbreth-Holm-Swarm (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) с EZ-link плюс активированная пероксидаза хрена (HRP) в соответствии с протоколом производителя (Pierce). Активированный ламининовый зонд обессоливали на колонке Micro Bio-Spin P-30 (Bio-Rad). Мембраны инкубировали с меченым ламинином-HRP (5 мкг/мл) в течение ночи при 4°С. После тщательной промывки ламининовым покровным буфером, содержащим 5% обезжиренного сухого молока, с помощью ECL проявляли пятна.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Дополнительный материал

доступен на веб-сайте HMG в Интернете.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была поддержана Фондом исследования мышечной дистрофии Каролины в Фонде здравоохранения Каролины.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят Трейси Уильямсон (животноводческий комплекс), Джейн Ингрэм и Трейси Уоллинг (центр гистологии), Дэвида Рэдоффа и Дейзи Райдингс (центр электронной микроскопии), Тоню Бейтс, Крис Беннетт, Джуди Вакрис и Нури Стюервальд (центр молекулярной биологии). ), Айлану Лу и Полу Шейфеле (inGenious Targeting) за их техническую помощь.

Заявление о конфликте интересов . Ни один не заявил.

ССЫЛКИ

1, .

Мембранная организация комплекса дистрофин-гликопротеин

,

Клетка

,

1991

, vol.

66

 (стр. 

1121

1131

)2,  .

Роль комплекса дистрофин-гликопротеин в качестве трансмембранного линкера между ламинином и актином

,

J. Cell Biol.

,

1993

, том.

122

 (стр.

809

823

)3,  .

Генетическая и молекулярная основа мышечной дистрофии: роль сцепления клеток с матриксом в патогенезе

,

J. Hum. Жене.

,

2006

, том.

51

 (стр. 

915

926

)4,  ,  ,  ,  .

Дефицит гликопротеинового компонента комплекса дистрофина в дистрофических мышцах

,

Nature

,

1990

, vol.

345

 (стр. 

315

319

)5,  .

Гликопротеиновый комплекс, прикрепляющий дистрофин к сарколемме

,

J. Biochem

,

1990

, vol.

108

 (стр. 

748

752

)6

Ибрагимов-Бекровная

О.

,  ,  ,  ,  ,  .

Первичная структура гликопротеинов, связанных с дистрофином, связывающих дистрофин с внеклеточным матриксом

,

Nature

,

1992

, vol.

355

 (стр. 

696

702

)7,  ,  ,  .

Роль гликопротеинов, связанных с дистрофином, и утрофина в индуцированном агрином кластеризации AChR

,

Cell

,

1994

, vol.

77

 (стр. 

663

674

)8,  ,  ,  .

Дистрогликан-альфа, гликопротеин, ассоциированный с дистрофином, является функциональным рецептором агрина

77

 (стр. 

675

686

)9,  ,  ,  ,  .

Связывание доменов G цепей ламинина альфа1 и альфа2 и перлекана с гепарином, сульфатидами, альфа-дистрогликаном и некоторыми белками внеклеточного матрикса

18

 (стр. 

863

870

)10,  ,  ,  ,  ,  .

Стехиометрический комплекс нейрексинов и дистрогликана в головном мозге

,

J. Cell Biol.

,

2001

, том.

154

 (стр. 

435

445

)11,  ,  .

α-Дистрогликан представляет собой рецептор ламинина, участвующий в сборке внеклеточного матрикса на мышечных трубках и жизнеспособности мышечных клеток

,

J. Cell Biol.

,

1999

, том.

145

 (стр. 

1325

1340

)12,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Дистрофический фенотип, индуцируемый in vitro путем блокады антителами взаимодействия мышечного альфа-дистрогликана и ламинина

,

J. Cell Sci.

,

1999

, том.

112

 

Точка. 2

(стр.

209

216

)13,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Пикачурин, лиганд дистрогликана, необходим для образования синапсов фоторецепторной ленты

,

Nat. Неврологи.

,

2008

, том.

11

 (стр. 

923

931

)14,  ,  ,  .

Электронно-микроскопические данные о муциноподобной области в альфа-дистрогликане куриных мышц

,

FEBS Lett.

,

1995

, том.

368

 (стр. 

139

142

)15,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Аберрантное гликозилирование альфа-дистрогликана вызывает дефект связывания ламинина в мышцах цыплят с мышечной дистрофией

,

FEBS Lett.

,

2005

, том.

579

 (стр. 

2359

2363

)16,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Посттрансляционное нарушение взаимодействий дистрогликан-лиганд при врожденных мышечных дистрофиях

418

 (стр. 

417

422

)17,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Делеция дистрогликана головного мозга резюмирует аспекты врожденной мышечной дистрофии

418

 (стр. 

422

425

)18,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Уникальная роль дистрогликана в миелинизации периферических нервов, узловой структуре и стабилизации натриевых каналов

38

 (стр. 

747

758

)19,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Пороки развития головного мозга и глаз, напоминающие синдром Уокера-Варбурга, повторяются у мышей путем делеции дистрогликана в эпибласте

,

J. Neurosci.

,

2008

, том.

28

 (стр. 

10567

10575

)20,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Нарушение зрения при отсутствии дистрогликана

,

J. Neurosci.

,

2009

, том.

29

 (стр.

13136

13146

)21.

Врожденные мышечные дистрофии с участием O -маннозного пути

,

Curr. Мол. Мед.

,

2007

, том.

7

 (стр. 

417

425

)22,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Мутации в гене LARGE человека вызывают MDC1D, новую форму врожденной мышечной дистрофии с тяжелой умственной отсталостью и аномальным гликозилированием альфа-дистрогликана

Hum.Мол. Жене.

,

2003

, том.

12

 (стр. 

2853

2861

)23,  ,  , 

Бельтран-Валеро де Бернабе

D.

, , , , , , , , , 

Мутации POMT2 вызывают гипогликозилирование альфа-дистрогликана и синдром Уокера-Варбурга

,

J. Med. Жене.

,

2005

, том.

42

 (стр. 

907

912

)24

Бельтран-Валеро де Бернабе

D.

,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , , , 

Мутации в гене O-маннозилтрансферазы POMT1 вызывают тяжелое нарушение миграции нейронов, синдром Уокера-Варбурга

,

Am. Дж. Хам. Жене.

,

2002

, том.

71

 (стр. 

1033

1043

)25,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Мышечная дистрофия и нарушение миграции нейронов, вызванное мутациями в гликозилтрансферазе, POMGnT1

,

Dev. Ячейка

,

2001

, том.

1

 (стр. 

717

724

)26,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Древняя ретротранспозальная вставка вызывает врожденную мышечную дистрофию типа Фукуяма

394

 (стр. 

388

392

)27,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Мутации в гене родственного фукутину белка (FKRP) идентифицируют поясно-конечностную мышечную дистрофию 2I как более мягкий аллельный вариант врожденной мышечной дистрофии MDC1C

,

Hum. Мол. Жене.

,

2001

, том.

10

 (стр.

2851

2859

)28,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Мутации в гене родственного фукутину белка (FKRP) вызывают форму врожденной мышечной дистрофии со вторичным дефицитом ламинина альфа2 и аномальным гликозилированием альфа-дистрогликана

,

Am. Дж. Хам. Жене.

,

2001

, том.

69

 (стр. 

1198

1209

)29,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Демонстрация активности протеина O-маннозилтрансферазы млекопитающих: коэкспрессия POMT1 и POMT2, необходимая для ферментативной активности

,

Proc.Натл акад. науч. США

,

2004

, том.

101

 (стр. 

500

505

)30,  ,  ,  ,  .

Характеристика БОЛЬШОГО семейства предполагаемых гликозилтрансфераз, связанных с дисстрогликанопатиями

,

Гликобиология

,

2005

, том.

15

 (стр. 

912

923

)31,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Молекулярное распознавание с помощью LARGE необходимо для экспрессии функционального дистрогликана

,

Cell

,

2004

, vol.

117

 (стр. 

953

964

)32,  .

Крупная мышь может модифицировать сложные N- и муциновые О-гликаны на альфа-дистрогликане, чтобы индуцировать связывание ламинина

,

J. Biol. хим.

,

2005

, том.

280

 (стр. 

20851

20859

)33,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Внутриклеточное связывание фукутина и альфа-дистрогликана: связь с гликозилированием альфа-дистрогликана

,

Neurosci. Рез.

,

2006

, том.

56

 (стр. 

391

399

)34

Бельтран-Валеро де Бернабе

D.

,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , , 

Мутации в гене FKRP могут вызывать мышечно-глазно-мозговую болезнь и синдром Уокера-Варбурга

,

J. Med. Жене.

,

2004

, том.

41

стр.

e61

 35,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Аномалии экспрессии альфа-дистрогликана при мышечных дистрофиях MDC1C и LGMD2I

,

Am.Дж. Патол.

,

2004

, том.

164

 (стр. 

727

737

)36,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Фенотипический спектр, связанный с мутациями в гене родственного фукутину белка

,

Ann. Нейрол.

,

2003

, том.

53

 (стр. 

537

542

)37,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Клинико-молекулярная характеристика больных поясно-конечностной мышечной дистрофией 2I типа

,

Arch.Нейрол.

,

2005

, том.

62

 (стр. 

1894

1899

)38,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Сердечная и дыхательная недостаточность при поясно-конечностной мышечной дистрофии 2I

,

Ann. Нейрол.

,

2004

, том.

56

 (стр. 

738

741

)39,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Сравнительное исследование гликозилирования альфа-дистрогликана при дисстрогликанопатиях предполагает, что гипогликозилирование альфа-дистрогликана не всегда коррелирует с клинической тяжестью

,

Головной мозг.Патол.

,

2009

, том.

19

 (стр. 

596

611

)40,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Врожденные мышечные дистрофии с дефектом гликозилирования дистрогликана: популяционное исследование

,

Неврология

,

2009

, том.

72

 (стр. 

1802

1809

)41,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Снижение экспрессии родственного фукутину белка у мышей приводит к созданию модели мышечных дистрофий, связанных с фукутин-родственным белком

132

 (стр. 

439

451

)42,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Белок, родственный фукутину, локализуется в аппарате Гольджи, и мутации приводят к неправильной локализации в мышцах in vivo

36

 (стр. 

455

465

)43,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Функциональные требования к родственному фукутину белку в аппарате Гольджи

,

Hum. Мол. Жене.

,

2002

, том.

11

 (стр. 

3319

3331

)44,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Распространенная миссенс-мутация в альфа-саркогликане, связанная с заболеванием, не вызывает мышечную дистрофию у мышей

,

Hum. Мол. Жене.

,

2008

, том.

17

 (стр. 

1201

1213

)45,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Ингибирование маннозидазы I восстанавливает рекуррентную мутацию альфа-саркогликана R77C человека

,

Hum. Мол. Жене.

,

2008

, том.

17

 (стр. 

1214

1221

)46.

Условный контроль экспрессии генов у мышей

Nat. Преподобный Жене.

,

2001

, том.

2

 (стр. 

743

755

)47,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Рострокаудальная мышечная дистрофия, вызванная дефектом холинкиназы бета, первого фермента биосинтеза фосфатидилхолина

,

J. Biol. хим.

,

2006

, том.

281

 (стр.

4938

4948

)48,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Экспрессия вариантов сплайсинга интегрина альфа7бета1 во время регенерации скелетных мышц

,

Am. Дж. Патол.

,

2002

, том.

161

 (стр. 

1023

1031

)49,  ,  .

Повышение уровня альфа 7 бета 1-интегрина способствует пролиферации, адгезии и устойчивости мышечных клеток к апоптозу без изменения экспрессии генов

Am. Дж. Физиол. Клеточная физиол.

,

2008

, том.

294

 (стр. 

C627

C640

)50,  ,  ,  ,  ,  .

Измененная экспрессия интегрина альфа7бета1 при мышечных дистрофиях человека и мыши

,

J. Cell Sci.

,

1997

, том.

110

 

(Pt. 22)

(стр. 

2873

2881

)51,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Вовлечение головного мозга при мышечных дистрофиях с нарушением гликозилирования дистрогликана

,

Ann. Нейрол.

,

2008

, том.

64

 (стр. 

573

582

)52,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Генетическая модель заболевания мышц, глаз и головного мозга у мышей, лишенных белка O -манноза 1,2- N -ацетилглюкозаминилтрансферазы (POMGnT1)

Mech. Дев.

,

2006

, том.

123

 (стр. 

228

240

)53,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Фукутин необходим для поддержания целостности мышц, кортикального гистиогенеза и нормального развития глаз

Hum.Мол. Жене.

,

2003

, том.

12

 (стр. 

1449

1459

)54,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Патология скелетных, сердечных и язычных мышц, нарушение передачи сетчатки и дефекты миграции нейронов у мышей Large(myd) определяют естественную модель мышечно-глазно-мозговых нарушений с дефицитом гликозилирования

,

Hum. Мол. Жене.

,

2002

, том.

11

 (стр. 

2673

2687

)55,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Хрупкость базальной мембраны лежит в основе эмбриональной летальности у фукутин-нулевых мышей

Neurobiol.Дис.

,

2005

, том.

19

 (стр. 

208

217

)56,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Целенаправленное нарушение гена синдрома Уокера-Варбурга Pomt1 у мышей приводит к гибели эмбрионов

Proc. Натл акад. науч. США

,

2004

, том.

101

 (стр. 

14126

14131

)57,  ,  ,  ,  ,  , 

Ибрагимов-Бескровная

О.

,  .

Дистрогликан необходим для раннего эмбрионального развития: нарушение мембраны Рейхерта у мышей с нулевым Dag1

,

Hum.Мол. Gen

,

1997

, том.

6

 (стр. 

831

841

)58,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Мутации изменяют секрецию родственного фукутину белка

Biochim. Биофиз. Acta

,

2009

, том.

1802

 (стр. 

253

258

)59,  ,  .

Высокая распространенность и корреляция между фенотипом и генотипом поясно-конечностной мышечной дистрофии типа 2I в Дании

,

Ann. Нейрол.

,

2006

, том.

59

 (стр.

808

815

)60,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Спектр изменений головного мозга у пациентов с врожденной мышечной дистрофией и мутациями гена FKRP

Arch. Нейрол.

,

2006

, том.

63

 (стр. 

251

257

)61,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , и др.

Снижение пролиферативной активности первичных POMGnT1-нулевых миобластов in vitro

,

Mech. Дев.

,

2009

, том.

126

 (стр.

107

116

)

Примечания автора

© The Author, 2010. Опубликовано Oxford University Press. Все права защищены. Чтобы получить разрешение, отправьте электронное письмо по адресу: [email protected]

.

Наталья Зинченко Состояние, возраст, биография, день рождения, рост, факты

Узнайте о Наталья Зинченко Состояние, биография, возраст, день рождения, рост, молодость, семья, знакомства, партнер, вики и факты.

Кто такая Наталья Зинченко:

Наталья Зинченко — известная бывшая украинская футболистка. Она родилась 3 октября 1979 года в Украине.

На Buzzlearn.com Наталья указана как успешная футболистка, родившаяся в 1979 году. Она также входит в список самых богатых людей Украины. Ее имя «Наталья», а фамилия «Зинченко».

Биография:

9029 Bio / Wiki 9255 12
    2 Наталья Zinchenko
      2 футболист AGE
        2 42 Дата рождения Октябрь 3, 1979
          2 Место рождения
            2 Ukraine Звезда
              2 Libra
                2 Страна
                  2
                    2 Пол
                      2 Пол
                        2 Женский 0 0 День рождения, Возраст и Знак зодиака:

                        Наталья Зинченко родилась 3 октября 1979 года, а родилась в среду.Ей 42 года. Знак зодиака Натальи — Весы, а цветок ее рождения — бархатцы и космос.

                        6 2 День рождения
                          2 Среда
                          2 Libra
                          2 Cardinal Air
                        Рождения 3-октябрь
                        года рождения
                        Рождения знака
                        Знак рождения Двойственность
                        Знак рождения Модальности и элемент
                        Противоположный знак Ories
                        0 Высота, вес и физическая статистика:

                        Наталья Зинченко на 5 футов 7 дюймов.

                        6
                          2 Вес
                          2
                          2 Bust
                            2 N / A
                          2 Талия
                            2 N / A
                          2 N / A
                        2 N / A
                          2 N / A
                          2 Размер обуви
                            2 N / A
                        Высота 1,69 м (5 ‘7 «)
                        HIP N / A
                        N / A
                        N / A
                        0 ранняя жизнь и семья:
                          2 не известен
                          2 Spouse Имя
                        не известно
                          2 Неизвестно

                        5 Образование:

                        Семья информации
                        Родители
                        Детское имя
                        Количество детей (ы) Недоступно
                        Имя партнера Н/Д
                        Родственник(и) Имя Н/Д

                        6
                          2 N / A
                          2 N / A
                        N / A N / A N / A
                          2 College
                        N / A
                          2 Высшая школа
                        Образование
                        Н/Д
                        Школа Н/Д

                        Наталья Зинченко Чистая стоимость:

                        Собственный капитал или чистый доход Натальи Зинченко оценивается в 1-5 миллионов долларов.Она заработала такое состояние благодаря своей основной карьере футболиста.

                        6
                          2 Годовой зарплата
                          2 Подвертывание
                          2 Источник дохода
                          2 Источник
                        2
                          2 Состояние проверки богатства
                            2 не проверено
                        Чистая стоимость $ 1 млн. — 5 млн. Долл. США
                        До годовой зарплаты

                        Жив или мертв?

                        По нашей базе Наталья Зинченко жива.

                        Краткая информация:

                        Вот несколько интересных фактов о Наталье Зинченко:

                        * Родом из Украины.

                        * Ее знак зодиака — Весы, а элемент знака зодиака — Воздух.

                        * Ее двойственность — напористость, а противоположный солнечный знак — Овен.

                        Часто задаваемые вопросы (FAQ):


                        Ссылка: Вики и газеты.

                        Рост Натальи Зинченко — Какой рост у Натальи Зинченко?

                        Наталья Зинченко родилась 3 октября 1979 года в Десне, Украина.В 41 год рост Натальи Зинченко составляет 5 футов 6 дюймов (169,0 см).

                        Теперь мы открываем биографию Натальи Зинченко, возраст, физические данные, знакомства / дела, семью и обновления карьеры. Узнайте, насколько она богата в этом году и как она тратит деньги? Также узнайте, как она заработала большую часть собственного капитала в возрасте 41 года?

                        Популярный как н/д
                        Род занятий н/д
                        Возраст 41 год
                        Знак Зодиака Весы
                        Дата рождения 3 октября 1979 г.
                        День рождения 3 октября
                        Место рождения Десна, Украина
                        Национальность Украина

                        Мы рекомендуем вам ознакомиться с полным списком известных людей, родившихся 3 октября.Она является членом известной группы в возрасте 41 года .

                        Наталья Зинченко Вес и мерки

                        Физическое состояние
                        Вес Недоступно
                        Размеры тела Недоступно
                        Цвет глаз Недоступно
                        Краска для волос Недоступно

                        Статус знакомств и отношений

                        В настоящее время она не замужем.Она ни с кем не встречается. У нас мало информации о ее прошлых отношениях и ее предыдущих помолвках. Согласно нашей базе данных, у нее нет детей.

                        Семья
                        Родители Недоступно
                        Муж Недоступно
                        Брат и сестра Недоступно
                        Дети Недоступно

                        Наталья Зинченко Чистая стоимость

                        Ее собственный капитал значительно вырос в 2018–2019 годах.Итак, сколько стоит Наталья Зинченко в возрасте 41 года? Источником дохода Натальи Зинченко в основном является успешная карьера. Она из Украины. Мы оценили состояние, деньги, зарплату, доход и активы Натальи Зинченко.

                        Чистая стоимость в 2020 году 1 миллион долларов — 5 миллионов долларов
                        Заработная плата в 2019 году На рассмотрении
                        Чистая стоимость в 2019 году В ожидании
                        Заработная плата в 2019 году На рассмотрении
                        Дом Недоступно
                        Автомобили Недоступно
                        Источник дохода

                        Наталья Зинченко Социальная сеть

                        Хронология

                        Зинченко присоединился к «Звезде Пермь» в 2007 году и, кроме того, был капитаном команды, в этом качестве команда вышла в финал женского Кубка УЕФА 2008–09.Ранее она выступала за рязанский ВДВ. Выйдя на пенсию из-за травмы в 2010 году, она заменила Шека Борковски на посту менеджера «Звезды Пермь».

                        Входила в состав сборной Украины и дебютировала 22 октября 1995 года против сборной Венгрии.

                        Наталия Зинченко (укр. Наталія Зинченко; родилась 3 октября 1979 г.) — бывшая украинская футболистка, которая в настоящее время является менеджером «Звезды Пермь».

                        Что означает фамилия Зинченко?

                        Имя
                        <100
                        в США
                        с 1880 г.

                        Фамилия
                        143
                        в США
                        в 2010 г.

                        Какое имя Зинченко ?

                        Какое наиболее точное происхождение фамилии Зинченко ?

                        Что значит Зинченко?

                        Как произносится Зинченко

                        Мы заметили, что у вас есть микрофон.Если вы знаете, как произносится Зинченко, просто нажмите кнопку, чтобы записать. Мы сохраним его, просмотрим и опубликуем, чтобы помочь другим. Запись от детей до 18 лет запрещена.

                        Значение и происхождение

                        Что означает фамилия Зинченко? Продолжайте читать, чтобы найти введенные пользователем значения, словарные определения и многое другое.

                        Происхождение и значение Зинченко

                        Происхождение, отправленное пользователем


                        Сообщите нам происхождение и/или значение Зинченко ниже

                        Происхождение Зинченко

                        UnknownAfricanAfrican Голландский (африкаанс) AkanAmharicArabicAramaicBantuBerberChewaEgyptianEritreaGandaGeezHausaIgboIslamic / MuslimKikuyuKurdishLesothoLuhyaLuoNdebeleNigerianPersian / IranianPortugueseShonaSwahiliTswanaUrhoboXhosaYorubaZimbabweZuluAfrican AmericanAmericanAmerican SamoaAztec (науатль) CanadianDominican RepublicEnglishGrenadianHawaiianIslamic / MuslimJamaicanJewishMexicanPortuguesePuerto RicanNative AmericanArabicAramaicArmenianBengaliCambodianChineseGeorgianGujaratiHindiHinduIndian (санскрит) IndonesianIslamic / MuslimJapaneseJewishKannadaKazakh (Казахстан) KoreanKurdishKyrgyz (Кыргызстан) MalayalamMarathiMongolianNepaliOdiaPakistaniPersian / IranianFilipino (Филиппины) PunjabiRussianSanskritSlavicTajik (Таджикистан) TamilTelugaThaiTibetanUrduUzbek (Узбекистан) VietnameseAboriginalAmerican SamoaAustralianFijianFilipino (Филиппины)ГавайскийИсламский/МусульманскийМаориНовая ЗеландияПолинезийский/ГавайскийАлбанскийАнглосаксонскийАрабскийАрамейскийАрмянскийБаскскийБолгарскийКельтскийХорватскийКипрЧешскийДатскийГолландскийАнглийскийВосточный onianFinnishFrenchGaelicGeorgianGermanGreekHebrewHungarianIcelandicIrishIslamic / MuslimItalianJewishKurdishLatinLatvianLithuanianMacedonianNorwegianPersian / IranianPolishPortugueseRomanRomanianRumantschRussianScandinavianScottishSerbianSlavicSlovak (Словакия) Словенская (Словения) SpanishSwedishTurkishUkrainianWelshYugoslavianFictionSlang

                        Спасибо! Мы рассмотрим вашу заявку в ближайшее время!

                        Z за рвение, ваш интерес к жизни.

                        I за беспристрастный, великий арбитр

                        N для номер один, обязательно позаботьтесь о себе превыше всего

                        C для подходит, как вам нравится.

                        H для скромное, святое качество.

                        E для легко собирается, без рюшей.

                        N за знатны, знатны твои подвиги

                        K для ребенка, ребенка внутри.

                        O для Внешний вид, всем радующий.

                        Известные лица с фамилией Зинченко

                        Александр Зинченко — футболист ФК «Уфа», ФК «Шахтер» (Донецк), сборной Украины по футболу до 16 лет, сборной Украины по футболу до 17 лет и сборной Украины по футболу до 18 лет.Александр родился 15 декабря 1996 года в Радомышле.

                        Наталья Зинченко — футболистка ВФК «Дончанка», Рязанского ВДВ, ФК Энергия Воронеж, Звезда 2005 Пермь и женской сборной Украины по футболу. Наталья родилась 3 октября 1979 года в Украине.

                        Его военная служба закончилась в 1950 году.Федор родился 19 сентября 1902 года в Кривошеинском районе. Он скончался 15 октября 1991 года.

                        Владимир родился 28 мая 1959 года.

                        Анатолий Зинченко — футболист ФК «Ротор Волгоград», ФК СКА Ростов-на-Дону, ФК «Зенит» (Санкт-Петербург), ФК «Динамо» (Санкт-Петербург), СК «Рапид Вена» и сборной Советского Союза по футболу.Анатолий родился 8 августа 1949 года в Новокузнецке.

                        Где популярна фамилия Зинченко?

                        Международные проценты на Зинченко

                        Интерес зависит от того, сколько людей просмотрело это имя в каждой стране, и масштабируется на основе общего количества просмотров по каждой стране, поэтому большие страны не всегда проявляют наибольший интерес.Более темно-синий цвет на карте указывает на то, что люди в стране чаще ищут это имя.

                        Более длинные столбцы гистограммы указывают на то, что люди в стране больше интересуются названием. Не все страны, проявившие интерес к названию, перечислены на гистограмме.

                        Популярность в США

                        Просмотрите популярные имена по штатам или регионам.

                        NortheastMidwestSouthWestNew EnglandMideastGreat LakesPlainsSoutheastSouthwestRocky MountainFar WestAlabamaAlaskaArizonaArkansasCaliforniaColoradoConnecticutDelawareFloridaGeorgiaHawaiiIdahoIllinoisIndianaIowaKansasKentuckyLouisianaMaineMarylandMassachusettsMichiganMinnesotaMississippiMissouriMontanaNebraskaNevadaNew HampshireNew JerseyNew MexicoNew YorkNorth CarolinaNorth DakotaOhioOklahomaOregonPennsylvaniaRhode IslandSouth CarolinaSouth DakotaTennesseeTexasUtahVermontVirginiaWashingtonWashington D.C.Западная ВирджинияВисконсинВайоминг

                        Популярность фамилии Зинченко

                        На карте показана абсолютная популярность имени Зинченко как фамилии в каждом из штатов. См. другие популярные имена в Нью-Йорке, Индиане или Пенсильвании.

                        Этническая принадлежность Зинченко У.С.
                        █  Белый 97,90% 64,26%
                        █  Афроамериканец 0,00% 11,96%
                        █  Выходец из Азии, Гавайских островов и островов Тихого океана 0,00% 4,85%
                        █  Американские индейцы и коренные жители Аляски 0.00% 0,69%
                        █  Две или более национальности 0,00% 1,76%
                        █  Латиноамериканец или латиноамериканец 0,00% 16,26%

                        Фамилия Зинченко

                        Чаще всего встречаются люди с фамилией Зинченко Белые

                        Забавные факты о фамилии Зинченко

                        • Насколько популярна фамилия Зинченко? Фамилия Зинченко была 120 901 st самым популярным именем в 2010 году.
                        • Насколько уникальна фамилия Зинченко? Из 6 215 834 записей в общедоступных данных Управления социального обеспечения США имя Зинченко отсутствует. Возможно, имя, которое вы ищете, встречается менее пяти раз в год.
                        • Странности с фамилией Зинченко: Имя, написанное наоборот, будет Oknehcniz . Случайная перестановка букв в имени (анаграмма) даст Nehnciozk .Как ты это произносишь?
                        • Сколько людей носит фамилию Зинченко? В 2010 году Бюро переписи населения США опросило 143 человека с фамилией Зинченко.
                        • Какова вероятность, что вы встретите человека с фамилией Зинченко? Зинченко — одна из самых уникальных зарегистрированных фамилий.

                        Какие Зинченко посетили эту страницу?

                        Именной плакат для Зинченко

                        (щелкните, чтобы сохранить версию в высоком качестве)

                        • Источники:
                        • У.S. Бюро переписи населения: часто встречающиеся фамилии из переписи 2000 г. (общественное достояние).
                        • Известные люди через Википедию: титулы и лицензия.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.